外泌体研究

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qEV尺寸排阻外泌体分离柱

qEV尺寸排阻外泌体分离柱具有简便、快速、容易标准化操作的特点,只需要15min就可以从多种类型样本中提取到完整的高纯度外泌体。并且相较于其他方法,qEV所提取的外泌体纯度更高、活性也更高,更适合蛋白组学研究。
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产品描述

 

       qEV尺寸排阻分离柱是由新西兰IZON公司研发和生产的一种基于尺寸排阻法色谱法(Size Exclusion Chromatography, SEC)原理的外泌体分离-纯化技术。该技术具有简便、快速、容易标准化操作的特点,只需要15min就可以从多种类型样本中提取到完整的高纯度外泌体。并且相较于其他方法,qEV所提取的外泌体纯度更高、浓度更高、活性也更高,还可以重复使用。qEV分离的外泌体尤其适用于外泌体蛋白组和外泌体功能实验之用。

 

 
 

 

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-原理

        qEV是基于分子排阻法SEC原理,按照分子粒径进行分段分离的方法。将生物样品流经具有固定孔隙的SEC填充物,吸附粒径较小的分子如蛋白、脂类等,而较大粒径的分子或颗粒不能进入孔隙。在缓冲液的作用下,较大粒径的囊泡(外泌体)流速快,在特定的阶段会被洗脱出来进入样品收集管,成为实验样品,而小分子物质则需要更长的洗脱时间,最终在特定时间流入废液缸。

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-操作流程(点击观看视频

1. 用洗脱缓冲液冲洗柱子。

2. 装入500μL样品。

3. 最开始的3ml是空隙体积,继续向分离柱中添加PBS以洗脱囊泡(外泌体)。

4. 收集空隙体积后的1.5mL液体为高纯度外泌体。

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-优势

 ●   高纯度:去除99%以上的可溶性蛋白质,去除95%以上高密度脂蛋白

 ●   无损伤:保持细胞外囊泡的完整性和生物功能

 ●  标准化:每根分离柱均经过标准化、质量保证,并通过ISO13485标准认证

 ●  可靠性:只要15min就可以得到完整外泌体样本,已经在大规模的实验室试验得到证实

 ●  适用性:适用于多种类型样品的外泌体提取,包括:血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液、唾液等;尤其适用于外泌体功能研究中,用于细胞培养或动物注射的高纯度外泌体的获得

       如上图所示,血清样品中收集的组分,用qNano其进行定量测量。在280纳米处用吸光度法测定蛋白质的相对浓度。数据表明,收集的第7至9组分具有最高浓度的囊泡(外泌体),而污染的血清蛋白洗脱的分数为第11至30组分(左图)。通过比较分离前和分离后的囊泡(外泌体)与蛋白质浓度比,第7组分的囊泡富集量为蛋白质的6000倍(右图)。根据样品的不同,如果下游分析分别需要更高的囊泡(外泌体)纯度或更高的囊泡(外泌体)产量,可将第7至9部分或第7至11部分汇集在一起。

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-产品规格

 

qEV与超速离心技术的对比

案例1   尺寸排阻SEC比超离UC获取外泌体的纯度更高

       

       该文献通过对滑膜液经过相同的预处理后,分别使用超离、密度梯度离心和尺寸排阻进行外泌体的分离。并通过WB、TEM对其进行鉴定分析。

      上图中红框所示的ApoA-1是HDL的标志物,可以发现UC和DGC都无法有效去除HDL,而SEC的WB图中,外泌体标志物的出现和HDL标志物和血清白蛋白的出现几乎不存在时间上的重叠,所以SEC可以收集到比较纯净的外泌体。

       上图中超离电镜下的图像,不仅背景杂质多,而且发生了聚集现象,这种聚集会对下游分析产生较大不利影响。相比之下,SEC的背景纯净,外泌体特征明显。

 

案例2   尺寸排阻SEC比超离UC获取外泌体生物活性更强

       该实验研究了使用超离UC和尺寸排阻SEC分离的心肌祖细胞(HMECs)培养液的外泌体的功能可能的差异。通过外泌体刺激细胞,诱导EKR磷酸化,然后通过比较外泌体刺激后的pEKR和EKR的比率,来评价不同分离方法制备外泌体的功能活性。

      上图WB显示,在相同条件下,无论总蛋白量变化还是粒子数变化,用SEC的方法比超离他的pERK / ERK比率更高,表明SEC收集到的外泌体具有更高的生物活性。

 

案例3 尺寸排阻SEC比超离UTC更适合进行血浆外泌体蛋白质组学分析

       该文献通过高分辨质谱分析,比较了SEC和UTC分离的血浆外泌体,在五次技术重复中鉴定的蛋白数量、信号强度等方面的差异。结果发现,相较于超离,SEC得到的外泌体,蛋白鉴定数量更多(图A,SEC 1,268±102,UTC 319±45),相同蛋白的定量CV值更小(图B,SEC 562种蛋白质的CV低于25%,而UTC只有73种蛋白质达到这一阈值),且相同外泌体marker蛋白,SEC信号值普遍比UTC更高(图C)。

      上述几篇文献将尺寸排阻SEC与超离UC、密度梯度离心DGC在收集到外泌体的纯度、生物活性和得率方面作比较,通过实验数据、电镜图、WB图像,发现SEC相较于其他两种分离方法,获取的外泌体纯度更高、生物活性更强、更适合蛋白组学实验。

|   相关文献

[1]. Vanderboom Patrick M,, et al. A size-exclusion-based approach for purifying extracellular vesicles from human plasma.[J] .Cell Rep Methods, 2021, 1: undefined.

[2].Freitas D, et al. Different isolation approaches lead to diverse glycosylated extracellular vesicle populations.J Extracell Vesicles. 2019 Jun 3;8(1):1621131.

[3]. Xing F, et al. Loss of XIST in Breast Cancer Activates MSN-c-Met and Reprograms Microglia via Exosomal miRNA to Promote Brain Metastasis. Cancer Res. 2018 Aug 1; 78(15): 4316-4330.
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[5]. Ramirez M, et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 2018 Jan 18; 10(3): 881-906.

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[9]. Takov K,et al.Comparison of small extracellular vesicles isolated from plasma by ultracentrifugation or size-exclusion chromatography: yield, purity and functional potential.J Extracell Vesicles..2018 Dec 28;8(1):1560809. 

关键词:
外泌体、超速离心、超离、尺寸排阻、SEC
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发布时间:2021-08-11 17:21:10

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