IMC空间蛋白质组学

|   技术原理

IMC在2014年由Giesen C等人在Nat Methods发表的研究中首次被应用。他们将新型激光消融装置引入到质谱仪检测中。固定在载玻片上的组织切片或细胞用一组稀土金属标签偶联的抗体进行标记后被插入消融室中，在消融室中通过在213nm下操作的脉冲激光扫描组织并聚焦到1μm直径的光斑大小。来自消融点的组织在每次激光照射时被气化，并由具有高时间保真度的惰性气体流携带到电感耦合等离子体离子源中，之后通过(CyTOF®) 的质量检测器进行同步分析。与每个点相关的金属标签被同时测量，再根据每个点的坐标位置进行索引。载玻片沿着扫描线在固定的激光束下方逐点移动扫描，顺序扫描后最终产生遍及组织或感兴趣区域的所有靶蛋白的信号强度图。经过软件处理和降维分析，获得具有组织结构的蛋白分布图谱和细胞亚群分布图谱。

（引自 Chang et al. 2017）

|   检测流程

1.   使用与不同稀土金属偶联的多种抗体对组织切片或固定化细胞进行同步标记;

2.   在 Hyperion组织质谱成像组件中通过脉冲激光进行组织消融;

3.   气化的样品通过惰性气体的等离子体流被驱动到CyTOF质谱仪的质量检测器进行分析，重建组织以及与每个检测点丰度的关联性；

4.   通过不同的软件进行信号（图像）分析和重叠。

（引自 Cereceda et al. 2021）

|   IMC技术优势

●   IMC拥有CyTOF技术相比于其他技术的所有优势。例如：IMC技术由于检测的是蛋白质的Marker，其细胞分型数据相较于单细胞测序更为准确，对于与占比较小的细胞亚群也能够精确分析。

●   重金属标签非常稳定，同批标记的抗体，在 2 周内检测信号依然稳定。不会出现检测通道之间窜色和相互干扰的情况。

●   IMC可在细胞和组织水平上同时检测多达 47 种蛋白质，其通量远远高于常规的免疫组织多重染色技术，可以获得更加丰富的蛋白质检测数据。

●   IMC技术实现了空间蛋白质组和空间细胞组成的定性定量分析，对于理解疾病发生机理和不同疾病状态最真实的病因提供了直接证据。并且，这些在组织中表达的特定蛋白质和聚集的细胞亚群，也为进一步的临床用药起到了关键的指导作用。

|   IMC检测列表

       目前，华盈生物的IMC技术平台已经对47种重要蛋白标签抗体进行了验证，可实现对这些蛋白质的准确检测。同时，如果现有抗体不能满足研究需求，华盈生物还可提供特定抗体的定制开发服务。

 检测列表

|   IMC应用方向

●   寻找与疾病发生、发展、复发相关的生物标志物（早期诊断、伴随诊断、复发预测、疾病分型等）

●   特定人群、特定部位的免疫特征分析（如孕妇、胎儿、肠道等）

●   新药药靶的发现与验证（先导化合物、激酶抑制剂、单抗药物等）

●   单细胞测序数据的验证与深入细胞分型

|   样本要求

●   切片样本需要用石蜡油密封后4度保存；蜡块样本4度保存

●   连续切片（Serial sections），便于锁定目标区域

●   厚度小于等于7μm

●   组织FFPE样本尽量新鲜，最好是半年以内制作，以石蜡块为佳。

|   应用案例

案例一 IMC发现了幼年型皮肌炎和红斑狼疮组织中不同的空间细胞亚型

研究者对6例幼年型皮肌炎（JDM）和4例红斑狼疮患者（cSLE）的皮肤组织进行了IMC分析，总共检测了包含CD14, CD15, CD16, CD56, CD68, CD11c, HLA-DR, BDCA2, CD20, CD27, CD138, CD4, CD8, E-cadherin, CD31, pan-keratin 和 collagen type I的17个蛋白。结果在JDM和cSLE皮肤中鉴定了14个细胞群，包括CD14+和CD68+巨噬细胞、骨髓和浆细胞样树突状细胞 (pDC)、CD4+和CD8+ T细胞和B细胞。总体而言，cSLE皮肤有较高的炎症细胞浸润，CD14+巨噬细胞、pDC和 CD8+ T细胞以及免疫-免疫细胞互作显著增加。而JDM皮肤表现出更强的先天免疫特征，具有更高的CD14+巨噬细胞占比和显著增加的内皮-免疫细胞间的空间互作关系。

案例二 IMC揭示先心病组织的免疫微环境特征

2022年发表在Nature上的一项研究通过IMC技术分析了先心病（CHD）患者心脏组织免疫微环境的状态和特征。研究者检测了21个患者和正常捐献者心脏组织切片的23个炎症蛋白。成簇分析鉴别了11个血管周细胞簇，这些细胞簇包含了血管平滑肌细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。特别是鉴定了3个分别表达CD68, CD14 and CD163的巨噬细胞（MΦ1–MΦ3）。其中MΦ1和MΦ2的定位邻近与那些表达免疫抑制因子（PD-L1、CD73、CD33）的T细胞，说明了这些巨噬细胞和抑制性T细胞间存在非常重要的关联。结合心脏组织的单细胞测序结果，发现了MΦ2细胞高表达IFNγ信号基因，而IFNγ可以通过诱导PD-L1的表达抑制T细胞活性，因此IMC对单细胞测序提供了组织空间水平上的验证。最后研究者发现了定位在ACTA2+ 血管附近的表达抗炎症蛋白的T细胞数目在患者中显著高于正常捐献者，说明了先心病患者的心脏组织处于免疫抑制状态。

|   相关文献：

1.  Giesen C, Wang HA, Schapiro D, Zivanovic N, Jacobs A, Hattendorf B et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nat Methods. 2014;11(4):417-422. 

2.  Chang Q, Ornatsky OI, Siddiqui I, Loboda A, Baranov VI, Hedley DW. Imaging Mass Cytometry. Cytometry A. 2017;91(2):160-169. 

3.  Cereceda K, Jorquera R, Villarroel-Espíndola F. Advances in mass cytometry and its applicability to digital pathology in clinical-translational cancer research. Adv Lab Med 2022;3(1): 5–16.

4. Turnier JL, Yee CM, Madison JA, Rizvi SM, Berthier CC, Wen F, Kahlenberg JM. Imaging mass cytometry reveals predominant innate immune signature and endothelial-immune cell interaction in juvenile myositis compared to lupus skin. Arthritis Rheumatol. 2022. Online ahead of print. 

5. Hill MC, Kadow ZA, Long H, Morikawa Y, Martin TJ, Birks EJ et al. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 2022. Online ahead of print.