中医治疗癌症分为“扶正”和“祛邪”两个方面，扶正即通过调节自身免疫功能来达到抗癌目的。祛邪则直接对付病灶，抑制肿瘤生长。其中，扶正固本法是传统中医药学的精华，是中医防治肿瘤中的主要特色。

特别是中医临床众多抗肿瘤验方中都含有黄芪成分，主要发挥其“扶正抗癌”的作用。但是黄芪抗肿瘤作用的机制尚不清楚。

2022年10月，南京中医药大学程海波团队联合南京大学孙洋团队在J Immunother Cancer（IF=12.469）发表了题为“Targeting cathepsin B by cycloastragenol enhances antitumor immunity of CD8 T cells via inhibiting MHC-I degradation”的研究成果，发现黄芪活性成分环黄芪醇（CAG）可靶向组织蛋白酶B减少肿瘤细胞上MHC-I的降解，从而增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。

研究首先利用MC38和CT26小鼠移植瘤模型来检测CAG的抗肿瘤作用，实验结果发现CAG能够显著抑制肿瘤的生长（图1）。

图1 环黄芪醇抑制肿瘤生长

为了揭示CAG抑制肿瘤生长的具体机制，研究使用scRNA-seq和scATAC-seq技术对肿瘤组织进行了分析，结果可以将细胞群分为四组：癌细胞、成纤维细胞、骨髓细胞和淋巴细胞，其中癌细胞分为8个亚组（图2A）。对肿瘤细胞群的分析发现，抗原呈递相关通路在多个细胞群中显著富集（图2B），并且抗原呈递相关通路相关基因在CAG组的表达水平明显高于对照组（图2C）。进一步使用scATAC-seq分析了CAG促进肿瘤细胞抗原呈递的具体原因，发现CAG处理组的肿瘤细胞群高度表达转录因子Fos、Junb、Jund、Fosb 和Fosl1（图2D），通过构建转录因子与相应基因相互作用的图谱发现CAG促进了肿瘤细胞抗原呈递相关基因的表达（图2E）。结果表明，CAG可以促进抗原呈递相关基因转录因子的表达，从而增强肿瘤细胞的抗原呈递功能。

图2 环黄芪醇增强肿瘤细胞抗原呈递

在确定CAG的主要作用于肿瘤细胞以后，为了确定CAG发挥抗肿瘤作用的特定靶蛋白，研究人员合成了 CAG 的生物素衍生物（只有3-OH可以反应），活性实验发现生物素标记的CAG同样促进小鼠MC38肿瘤细胞系中抗原呈递相关基因（H2-K1、Cd74和Anxa）的表达，对活性没有影响。随后，通过靶标响应可及性分析技术（Target-Responsive Accessibility Profiling, TRAP）寻找CAG的靶标蛋白（图3A），选择FC≥2 且p≤0.05的蛋白作为CAG的候选靶蛋白，发现组织蛋白酶B（CTSB）为CAG直接靶点（图3B），进一步通过细胞热迁移（图3C）、微量热泳（MST）（图3D）、分子对接和点突变等技术验证了CAG和靶标蛋白组织蛋白酶B直接结合。

图3环黄芪醇发挥抗肿瘤作用的靶蛋白确认

肿瘤抗原呈递是由MHC-I介导的，且有研究表明MHC-I在溶酶体中降解导致肿瘤免疫逃逸的发生，研究人员推测CAG 是否也可以通过其靶蛋白CTSB调节细胞膜上MHC-I的表达。通过将CTSB突变质粒转染到人HCT-116细胞中发现转染Y75A、A77V和G198V突变质粒后，CAG增强CD74和HLA-A基因表达的功能被破坏（图4A），表明CAG抑制CTSB介导的溶酶体中MHC-I的降解，并促进了MHC-I向细胞膜的再聚集。肿瘤免疫逃逸主要是由于肿瘤细胞抗原呈递功能丧失和免疫检查点受到抑制所致，于是研究人员推测CAG是否可以与PD-1抗体联合使用来杀死肿瘤，发现CAG和PD-1抗体联合组的抗肿瘤效果优于CAG和PD-1组，抗原呈递相关基因 H2-K1、Psmb8 和B2m 也得到了增强（图4B）。

图4 环黄芪醇通过CTSB调控肿瘤细胞抗原呈递功能

目前我国中药抗肿瘤研究大多聚焦于药效研究，但其具体的作用靶点及相关机制研究仍不是很清楚，且作用机制与临床中医理论的融合尚有欠缺，影响中药的现代化。该研究通过单细胞多组学测序、靶响应可及性分析等技术，发现扶正类中药黄芪活性成分CAG可以通过组织蛋白酶B（CTSB）抑制主要组织相容性复合物 I（MHC-I）介导的降解来促进肿瘤抗原呈递并增强 CD8 T 细胞的抗肿瘤能力，研究成果丰富了中医“扶正治癌”理论的科学内涵。

值得注意的是：

该课题近日在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF=14.903）上发表了“New opportunities and challenges of natural products research: When target identification meets single-cell multiomics”为题的综述文章，提出了基于靶标确证与单细胞多组学有机结合的天然产物机制研究新策略。而上述案例就是该策略的一个非常好的阐释。

1） 通过构建合适的疾病动物模型，验证天然产物对该模型的治疗效果；

2） 取疾病模型发病部位的组织，进行单细胞多组学测序（包括scRNA-seq和scATAC-seq分析等），鉴定给药前后显著变化的差异细胞亚群；进一步选取差异细胞亚群作为靶细胞；

3） 利用TRAP、DARTS、20K芯片等策略寻找天然产物在靶细胞内的结合蛋白，并使用ITC、SPR、MST等技术进行靶标蛋白的结合确证；

4） 结合动物水平的基因敲除/敲入和细胞水平的敲低/过表达以及类器官水平验证该靶标蛋白的生物学功能，并对下游通路进行分析以明确天然产物与该靶标蛋白结合影响疾病进展的机制。

总之，单细胞组学技术在发现药效物质、构建作用网络和阐明整合调节机制等方面有着巨大的应用潜力，为中医药现代研究带来了新机遇。

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