抗衰老研究一直是生命科学研究的热点之一，过去的二十年中，在衰老领域已取得众多的进展，如锻炼、热量限制、更换血液、清除衰老细胞（Senolytic疗法）等措施被报道可以发挥延寿作用，不少抗衰老小分子如雷帕霉素、二甲双胍、白藜芦醇等被陆续报道通过mTOR1、SIRT1等通路发挥作用。许多古籍记载的中药方剂，声称具有延年益寿功效，却很少通过科学证实。

2022年3月，国立台湾大学的王淑慧团队在Nature Communications（IF=14.919）上发表了题为“The flavonoid corylin exhibits lifespan extension properties in mouse”的研究成果，发现中药补骨脂（P. corylifolia）中活性化合物补骨脂宁（Corylin）可靶向Gtr1蛋白发挥延寿作用，增加酵母和小鼠20%~30%寿命，相当于把75岁人类延寿至97.5岁。

芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究衰老的最简单和广泛采用的模式生物之一，相对于其他生物，酵母的寿命可以很容易地量化。研究人员利用了一种MEP（mother enrichment program）方法检测酵母复制寿命（RLS），用来识别延长寿命的化合物。

为了寻找延寿的中药，研究人员检索了台湾地区的全民健康保险研究资料库以及《本草纲目》、《千金药方》、《神农本草》和《黄帝内经》等药典后，选择用于延长寿命和治疗衰老相关疾病（骨质疏松症、阿尔茨海默病等）的中药作为候选药物，在对这些中药进行交叉对比并询问临床中医师后，最终选取了33种单味中药和6种中药方剂（图1）。

图1 33种单味中药和6种中药配方

然而，这些中药是否真的能起到延寿作用尚未得到验证。于是，研究人员利用MEP方法进行筛选，基于水和乙醇提取物（图2A），从上述33种单味中药和6种中药方剂生成了78个候选组分，发现补骨脂的乙醇提取物（10μg/ml）可以显著延长酵母寿命（图2B）。补骨脂主要分布于印度和南亚，不同栽培条件下可能具有不同的化学成分，于是研究人员通过HPLC确定了补骨脂乙醇馏分中化学成分的指纹图谱（图2C），用于补骨脂活性组分的质量控制。

图2 补骨脂乙醇提取物延寿作用及色谱图

补骨脂的乙醇提取物中含有大量化合物。为了缩小候选范围，研究首先利用正己烷和水从乙醇粗提物分离出低极性和高极性化合物，发现补骨脂乙醇提取物的正己烷部分在10 μg/ml时将酵母寿命延长了20%（图3A）。在酿酒酵母中，SIR2和TOR1是调节酵母寿命的关键因素。机制研究发现，补骨脂乙醇提取物的正己烷部分延长sir2Δfob1Δ菌株寿命（图3B），而不能延长tor1Δ 缺失菌株寿命（图3C），表明补骨脂乙醇提取物的正己烷部分通过tor1途径发挥延寿作用。

图3 正己烷部分通过Tor1途径延长寿命

尽管研究人员验证了补骨脂乙醇提取物的正己烷部分能延长酵母寿命，但正己烷部分同样包含许多成分。为了从正己烷提取物中鉴定延长酵母寿命的活性化合物，研究人员利用柱层析分离的方法（正己烷:乙酸乙酯=20:1、10:1、7:1、5:1、1:1）将正己烷提取物分为5种组分（图4A），得到22种纯化合物，这些化合物都利用光谱进行了结构鉴定，包括2D-NMR、FT-IR和UV。进一步使用MEP方法检测了22种化合物，发现组分4中的2 种化合物corylin（12）和新巴伐异黄酮（14）（图4B）在15 μM时具有显著的延寿作用（图4C）。

鉴于：1）与新巴伐异黄酮相比，corylin能更有效的延长酵母寿命；2）corylin与新巴伐异黄酮具有几乎相同的基本骨架；3）在正己烷馏分中，corylin的含量是新巴伐异黄酮的10倍；故考虑corylin是补骨脂的主要活性成分。

图4 正己烷部分中的corylin发挥作用

为了确定corylin与延长寿命的相关机制，研究人员同样检测了corylin是否通过Sir2依赖性或Tor1依赖性途径发挥其作用，发现corylin延长sir2Δfob1Δ双缺失菌株寿命（图5A），而未能延长tor1Δ缺失菌株寿命（图5B），与前面补骨脂乙醇提取物的正己烷部分的数据一致。结果表明，corylin通过Tor1途径延长寿命。

图5 corylin通过Tor1途径延长寿命

图6 corylin靶向Gtr1蛋白发挥延寿作用

大部分中药/复方的疗效已经确定，但由于成分复杂，一般含有成百上千种化合物，确定其活性成分并验证其作用靶点一直是中药研究的科研工作者关心的问题。本案例给了我们一个非常完整的中药复方研究思路：

1）确定候选药物：研究通过检索《本草纲目》、《千金药方》、《神农本草》和《黄帝内经》等药典后，确定了候选药物33种单味中药和6种中药方剂。

2）确定疗效药物：将39种候选药物基于水和乙醇提取物生成78个候选验证组分，发现补骨脂的乙醇提取物为活性组分；

3）活性组分质控：不同地方的补骨脂活性组分可能不同，通过HPLC确定了补骨脂乙醇馏分中化学成分的指纹图谱。

4）缩小组分范围：研究利用正己烷和水从乙醇粗提物分离出低极性和高极性化合物，发现补骨脂乙醇提取物的正己烷部分发挥延寿作用。

5）确定活性成分：通过柱色谱法从正己烷提取物中分离出22种纯化合物并通过光谱分析鉴定，发现corylin具有显著延寿效果。

6）确定直接靶点：通过分子对接和点突变确定corylin的靶蛋白Gtr1及其结合位点，进一步通过Rescue实验证实了corylin通过靶蛋白Gtr1发挥延寿作用。

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