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5分钟读Cell:教你学习单细胞测序结果验证的新方法

5分钟读Cell:教你学习单细胞测序结果验证的新方法

  • 分类:华盈视角
  • 作者:瑞瑞
  • 来源:华盈生物公众号

【概要描述】根据不同研究目的,需要选取不同的策略对单细胞测序的结果进行验证。尤其是在高分期刊发表的文章中,蛋白层面验证单细胞测序结果显得尤为重要。例如通过流式细胞技术、质谱流式cyTOF技术和多重组织染色技术对特定细胞亚群进行表型和功能的验证就是常用技术。

5分钟读Cell:教你学习单细胞测序结果验证的新方法

【概要描述】根据不同研究目的,需要选取不同的策略对单细胞测序的结果进行验证。尤其是在高分期刊发表的文章中,蛋白层面验证单细胞测序结果显得尤为重要。例如通过流式细胞技术、质谱流式cyTOF技术和多重组织染色技术对特定细胞亚群进行表型和功能的验证就是常用技术。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:瑞瑞
  • 来源:华盈生物公众号
  • 发布时间:2022-09-22 16:03
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根据不同研究目的,需要选取不同的策略对单细胞测序的结果进行验证。尤其是在高分期刊发表的文章中,蛋白层面验证单细胞测序结果显得尤为重要。例如通过流式细胞技术、质谱流式cyTOF技术和多重组织染色技术对特定细胞亚群进行表型和功能的验证就是常用技术。但是,对免疫细胞亚型进行功能验证时,流式细胞技术常常只能检测胞内细胞因子的表达,并且流式检测通量有限,真正检测时还不得不舍弃一些重要指标。因此,流式细胞技术作为单细胞测序的验证技术其实并不理想。

今天通过 Cell上发表的一篇题为“Multi-Omics Resolves a Sharp Disease-State Shift between Mild and Moderate COVID-19”的 文章[1],为大家介绍一种最近很火的单细胞功能蛋白组的技术。该技术可以对单细胞测序结果中发现的特殊细胞亚群的功能,通过其分泌的32种细胞因子谱的变化进行综合性评估。有别于流式技术,单细胞功能蛋白组并不需要进行穿膜操作,直接对活细胞分泌到胞外的细胞因子进行动态观察,并且比流式技术通量高,它是单细胞亚群验证和进一步分类的关键技术。

 

这篇Cell文章纳入的是新冠肺炎患者和健康人群,对血浆和PBMC开展了包括蛋白组、代谢组、单细胞转录组、单细胞表面蛋白和单细胞功能蛋白组学的多组学联合分析。就单细胞测序结果而言,研究者发现很多不同类型的CD8+T细胞、CD4+T细胞、单核细胞在疾病组和对照组间的差异,例如效应性和耗竭性CD8+T细胞在疾病组中的占比都显著高于对照组。但是,有意思的是,根据疾病严重程度分析,疾病从中度期向重度期变化时,效应性CD8+T细胞反而有所下降。这就说明CD8+T细胞亚群数量的变化与疾病严重程度并不是直接相关的。

 

是否CD8+T细胞还会再分亚群??比如,这些增加的CD8+T细胞实际上从功能上又分为了不同阵营?

 

为了验证这个特别的现象,研究者通过单细胞功能蛋白组技术分析了CD8+ T细胞分泌的32中细胞因子的表达。这32种细胞因子包括了效应性、调节性、刺激性和炎症因子等类型。结果发现CD8+T细胞分泌的效应性因子(Granzyme B、IFN-γ、MIP-1α、 Perforin、TNF-α、TNF-β)在中度疾病期最强,并且多功能性CD8+T细胞的比例在中度疾病期最高,这些与单细胞测序的结果完全吻合。单细胞功能蛋白组数据不仅在蛋白层面验证了单细胞测序的结果,更是将单细胞测序发现的初步亚群分类证据,进一步引申到功能性细胞亚群分类上,让数据整体质量更上一层楼。

 

接下来我们看一下文章中的单细胞功能蛋白组学的基本流程:

 

|  样本:

1. 分选细胞:复苏PBMC(活性>95%)➩ 分选CD4+T、CD8+T、单核细胞;

2. 细胞刺激:CD4+T、CD8+ T细胞用anti-CD3和anti-CD28抗体体外刺激6h;单核细胞用LPS刺激12h

 

|  单细胞检测细胞因子:

1. 收集激活的细胞加入IsoCode微流控芯片中(含有12000个用于捕获单个细胞的微室和预先排列32种细胞因子捕获抗体的条形码);

2. IsoCode芯片放入全自动化的IsoLight仪器中,细胞在仪器中培养16h,然后通过双抗夹心法实时捕获细胞分泌的细胞因子,并检测累计的细胞因子信号强度;

3. 荧光信号自动导入IsoSpeak软件进行分析

|  芯片类型:

1.CD4+、CD8+ T细胞:采用人类适应性免疫应答因子检测芯片

 

2.单核细胞:采用人类自然免疫应答因子检测芯片:

 

相比流式检测,单细胞功能蛋白组同时检测的细胞因子种类多,因此数据分析的角度更广,呈现的形式也更丰富。

 

下面是摘自应用单细胞功能蛋白组不同文章的数据呈现形式:

1.比较组别之间的细胞因子信号强度

Sci Signal. 2015;8(381):ra59.

 

2.热图聚类分析

 

Cell. 2022;185(5):881-895.e20.

 

3.共分泌细胞因子热图

 

Am J Transplant. 2021;21(5):1902-1909.

 

4.T-SNE聚类分析

 

Blood Adv. 2021;5(22):4569-4574.

 

5. PCA分析

 

Sci Adv. 2022;8(8):eabd8056.

 

6.  多功能性指数(PSI)

 

Blood. 2018;132(8):804-814.

单细胞功能蛋白组已经是广泛应用的成熟系统,在免疫治疗伴随诊断标志物、CAR-T细胞的质量评估、CAR-T细胞治疗不良事件预测、自身免疫病、器官移植免疫排斥及单细胞测序验证等方面均可发挥重要作用。

近年来,国内外关于单细胞功能蛋白组技术发表的高分文章也越来越多,是一项非常值得期待,并能够解决单细胞研究棘手问题的新技术。

作为在蛋白检测领域具有10多年经验的品牌服务公司,华盈生物引进了完整的单细胞功能蛋白组服务体系。旨在帮助我们的合作者探索更多单细胞研究的奥秘,为科研、临床和工业研究提供帮助。华盈生物技术团队将为大家提供包括前期实验设计、样本收集、实验质控、数据分析等各环节的技术指导和服务,帮助大家轻松享受单细胞功能蛋白组学的技术优势。

|   参考文献

1. Su Y, Chen D, Yuan D, Lausted C, Choi J, Dai CL et al. Multi-Omics Resolves a Sharp Disease-State Shift between Mild and Moderate COVID-19. Cell. 2020;183(6):1479-1495.e20.

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