TMT定量蛋白质组学

       TMT是由美国Thermo Fisher 公司研发的一种多肽体外标记技术，最多可进行18例样本的蛋白质同批定量分析。TMT试剂由肽结合基团、平衡基团和报告基团三部分组成，可形成18 种等量异位标签。具体实验流程及原理如下图：以5例样品的TMT标记定量检测为例。在实验过程中将5例不同样品分别酶解成多肽片段→分别标记5种同位素标签→将5例标记好的多肽样品混合成1例总样品→进行HPLC分级（一般为10-15级）→分级后的多肽组分依次进入LC-MS/MS分析系统→二级MS阶段TMT平衡基团发生中性丢失，在低质量区产生多个报告离子→计算各报告离子峰面积，获得同一肽段不同样品间的相对丰度差异比值→加权计算肽段丰度获得总蛋白质相对定量值。

|   TMT标记定量技术优势

       从TMT标记定量蛋白质组学技术基本原理和实验流程中我们可以看出，该技术将不同的样本分别标记独立的TMT标签，再等量混合成1例pool样进入质谱分析。这种设计保证了所有样品均一性地经过质谱检测，从而防止了样品依次上样在质谱仪波动期引入的样品间系统误差。因此，一般研究认为TMT标记定量蛋白质组学技术相较于非标记定量蛋白质组学技术，在蛋白质组定量比较方面更加准确。

      同时，由于TMT实验将pool样进行HPLC分级处理，进行多次质谱进样，这样的实验流程不仅将进入质谱中样品的复杂度显著降低，从而减少了背景干扰，提高蛋白检出率。同时，不同HPLC组分中会保留同一蛋白多肽，经过质谱重复鉴定，在定性和定量方面均可提高蛋白质组学的数据准确度，也提高了蛋白质组的鉴定深度。因此，TMT标记定量蛋白质组学对于蛋白质组学深度检测需求的研究尤为适用。

|   主要仪器设备

|   项目经验

      华盈生物已经完成上百种类型样品的定量蛋白质组学检测，蛋白质组表达具有时空差异性，不同样本的蛋白谱各有特点，下图色块大小代表的是不同样本鉴定的蛋白数量差异。

|   样品要求

|   应用方向

●   发病机理研究

●   药物靶点研究

●   疾病标志物筛选

●   植物品种改良

●   工程菌改造

●   特殊功能蛋白质筛选

|   经典案例

TMT技术发现脂肪代谢紊乱底层机理

2017年5月美国学者Pamir N等运用TMT标记技术成功完成了20例小鼠脂肪组织蛋白质组定量比较。相关研究工作发表在蛋白质组学代表性杂志《Molecular & Cellular Proteomics》上（PMID: 28325852）。该研究实验设计巧妙，突破了iTRAQ和TMT等体外标记蛋白组学技术在同位素标签数量上的限制。

TMT蛋白质组学定量研究实验设计

研究人员将8周龄的20只小鼠处理分成四组（每组5只小鼠）：分别低脂喂养8周和18周，高脂喂养8周和18周。分别取各小鼠附睾脂肪组织进行3组TMT蛋白质组学定量分析，共计20例样品，通过3套TMT试剂“搭桥”方案完成了蛋白质组学定量分析。将3组质谱数据校准后进行组间蛋白谱比较，获得衰老（aging）和高脂饮食（HF）调控的脂肪组织特征蛋白谱，重新认识衰老与高脂饮食诱导的代谢紊乱疾病的物质基础，具体实验设计，见图1。

图1.多样本TMT蛋白质组学技术路线

高脂饮食易造成代谢紊乱

经过18个月高脂饮食喂养，小鼠出现了代谢状态系统性紊乱，随时间增长逐渐加剧。在低脂状态下，衰老是引起代谢紊乱主要因素，但紊乱程度较高脂环境要轻，见图2。

图2.高脂饮食和衰老造成糖脂代谢紊乱

蛋白质组改变伴随代谢紊乱发生

通过对比分析组间定量蛋白质组学数据的差异，研究人员发现衰老是引起蛋白质组变化的重要因素。而在高脂环境下，衰老对于蛋白质组的调变影响将被放大，表现为代谢相关差异蛋白显著增多。

图3.高脂饮食和衰老造成蛋白质组显著调变

      TMT定量蛋白质组学数据系统比较了衰老（Aging）和高脂饮食（HF）各自调控的脂肪组织特征蛋白谱，发现：低脂饮食条件下，衰老因素主要通过调控脂代谢、氨基酸代谢相关蛋白群改变引发代谢紊乱。而在高脂环境下，衰老对免疫系统、补体激活、基质重塑等蛋白群又产生了新的影响，造成了更严重的代谢紊乱发生，见如图4。

图4.差异蛋白谱互作网络分析

小结

通过本文可以看出，蛋白质组学研究具有很大的发展空间，可以填补很多研究知识上的空白。良好的实验设计可以突破技术限制，并让实验数据具有更强的说服力。

|   客户文献

[1]. Cai Q, Li Y, Zhang Y, et al. Xinshubao tablet ameliorates myocardial injury against heart failure via the DCN/PPARα/PGC-1α/P300 pathway. Biomed Pharmacother. 2023;166:115285.（中国中医科学院中药研究所）

[2]. Zhang L, Zhao Q, Cang H et al. Acute Myeloid Leukemia Cells Educate Mesenchymal Stromal Cells toward an Adipogenic Differentiation Propensity with Leukemia Promotion Capabilities. Adv Sci (Weinh). 2022 Mar 20;9(16):2105811.（浙江大学医学院附属儿童医院）

[3]. Fu Y, Zhou Y, Zhang YL, et al. Loss of neurodevelopmental-associated miR-592 impairs neurogenesis and causes social interaction deficits. Cell Death Dis. 2022;13(4):292.（同济大学）

[4]. Zhang F, Guo F, Liu Y, Zhang Y, Li D, Yang H. Shema Oral Liquid Ameliorates the Severity of LPS-Induced COPD via Regulating DNMT1. Front Pharmacol. 2022;13:903593.（中国中医科学院中药研究所）

[5]. Jia Z, Zhao C, Wang M, et al. Hepatotoxicity assessment of Rhizoma Paridis in adult zebrafish through proteomes and metabolome. Biomed Pharmacother. 2020;121:109558.（北京中医药大学中药学院）