该研究主要内容包括：

①收集正常对照(NC)、轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)参与者的脑脊液和血浆样本，并根据脑脊液中Aβ42、pTau和tTau水平进行ATN分类，用于设计蛋白质组学分析的发现集。

②生物标志物发现阶段，通过从16例脑脊液样本中分离出EVs并进行蛋白组学分析。

研究样本分为发现集和验证集，发现集选择16例脑脊液EVs进行蛋白组学检测，验证集对136例样本通过ELISA检测差异指标Cat B进行验证。

• 发现集：4例对照组(A−T−N−)、8例淀粉样蛋白沉积但无tau病理(4例A+T−N− 和4例A+T−N+)和4例淀粉样蛋白和tau病理(A+T+N+)。

• 验证集：50例AD患者，26例MCI患者和60例正常对照。

1、脑脊液EVs蛋白质组学分析

为了鉴定与AD进展相关的蛋白质，从发现集的脑脊液样本中分离EV并进行基于质谱的蛋白组学分析，共鉴定到1756个蛋白。在三个ATN分组中，共有11个EV蛋白存在显著差异。其中从A−T−N−到A+T−N−/A+T−N+的转变过程中，3个蛋白显著上调（RGMA、DNA2和CatB），3个蛋白显著下调（CNTN6、EXT1和H4F3）。从A+T−N−/A+T−N+到A+T+N+的转变过程中，2个蛋白显著上调（UN13C和PCNT），3个蛋白显著下调（PSMD1、NXPH1和 RFX5）。这些独特的蛋白可能参与脑细胞病理改变，可作为区分AD病理分期的潜在生物标志物。

图1 脑脊液EVs蛋白质组学分析

2、脑脊液和血浆EVs中CatB水平升高

由于CatB是在A−T−N−和A+T−N−/A+T−N+之间发生显著变化的蛋白之一，且参与淀粉样前体蛋白(APP)到Aβ的加工，因此研究人员选择CatB进行后续大队列验证。从136例配对脑脊液和血浆样本中分离EVs，将其分为7个ATN组，并通过ELISA方案检测CatB水平。脑脊液EVs的验证结果与蛋白质组学一致，结果显示与淀粉样蛋白阴性组（A—）比较，淀粉样蛋白阳性组（A+）CatB水平显著升高，且CatB浓度与脑脊液Aβ42浓度呈强负相关(r = - 065, P < 0.0001)，表明脑脊液EVs中CatB与脑脊液的Aβ状态密切相关。

由于外周血中EVs可用于监测中枢系统疾病的病变，因此研究人员对血浆样本进行血浆CatB和血浆EVs CatB水平检测。结果发现，血浆CatB 在ATN组之间没有显著差异，而血浆EVs中CatB有明显变化。与淀粉样蛋白阴性组（A—）比较，淀粉样蛋白阳性组（A+）血浆EVs CatB水平显著升高，且血浆EVs CatB浓度与脑脊液Aβ42浓度呈中度负相关，表明血浆EVs中CatB与脑脊液的Aβ状态密切相关。

图3  基于ELISA的血浆和血浆EVs中CatB的验证

循环小胞外囊泡作为神经系统疾病标志物研究主体有独特优势。

EV-CatB（而不是血浆CatB蛋白）有可能成为AD病理分期的候选生物标志物，我们在很多标志物研究文章中都可以看到类似结论。根据已有研究文章报告，血浆/血清EVs中标志物的检测，特别是循环血液样本中的神经来源EVs中特定标志物的检测，可实现神经系统疾病（如AD）的诊断，诊断效力等同于脑脊液。血清血浆等循环样本中的小细胞外囊泡（外泌体）在分泌过程中能有效富集且特异性携带生物分子并发挥信号传递作用。特征性的囊泡膜结构可很好的保护囊泡内生物分子，不易被蛋白酶/核酸酶等降解，其作为标志物研究有独特的优势。

此外，该论文的标志物筛选部分是从脑脊液EVs着手，并在血浆和脑脊液EVs进行验证。除此之外，也有不少研究文献的标志物是基于组织样本筛选，并在血浆EVs（而不是血浆）中得到反映，进而可以充当疾病诊断的循环生物标志物，研究思路和模式值得借鉴。

总的来说，在这项探索性研究中，研究人员对16例ATN分类的脑脊液EVs进行了蛋白质组分析，发现11种蛋白的水平在ATN阶段转变期间显著改变，可能与阿尔茨海默病的发病机制有关，并代表了疾病阶段分类的候选生物标志物。基于脑脊液和血浆EVs的ELISA实验证实，ATN过渡期间CatB水平改变。随着AD疾病的进展，脑脊液和血浆EVs中CatB水平升高。此外，脑脊液和血浆EVs中CatB水平与脑脊液Aβ42浓度呈负相关，表明EVs中的CatB可能参与AD淀粉样蛋白的发病机制，CatB可能是AD病理分期的潜在生物标志物和治疗靶点。

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