该研究分析了血浆EVs的转录组学特征，重点关注mRNA和lncRNA，发现：

①血浆EVs中血小板源性RNA和线粒体RNA水平丰富。

②PE组EVs中lncRNA表达增加，血小板源性和线粒体RNA减少，通过全转录组学测序筛选初步确认6个候选验证RNA指标。

③在EVs样本中进行标志物qPCR验证，PE组线粒体RNA（MT-TA、MT-ND2、MT-CYB）和血小板源性RNA（PPBP、PF4、CLU）表达降低。

研究样本分为发现集和验证集，其中发现集选择血浆EV进行全转录组测序（选取22-24周和36-38周样本进行检测），验证集样本包含血浆EVs、血浆和PBMC三种样本类型，结合经典qPCR对差异指标进行验证。

发现集（PE组n=7，对照组n=7）

验证集-EVs（PE组n=28，对照组n=32）

验证集-血浆（PE组n=35，对照组n=35）

1、血浆EVs差异RNA筛选

EVs中携带的生物分子在一定程度上可以反映EVs的来源，研究人员对血浆EVs进行了全转录组测序分析，重点关注了正常妊娠中丰度排名前100的RNA，发现了很多血小板和线粒体相关的RNA，提示血小板和线粒体是血浆EVs的主要来源。

与对照组和22-24周PE相比，36-38周PE中有大量lncRNA呈现上调趋势。与正常妊娠相比，36-38周PE的EVs中，血小板特征RNA （PF4、PPBP、TMSB4X、F13A1、TAGLN2、CLU和SPARC）显著降低，线粒体RNA也得到类似结论。

图1 血浆EVs差异RNA筛选

2、血浆EVs差异RNA验证

使用qPCR技术在血浆EVs中进行差异RNA验证。线粒体来源的RNA（MT-TA、MTCYB和MT-ND2）在22-24周PE中显著下调，并随着胎龄的增加进一步降低。血小板来源的RNA（PF4、PPBP和CLU）表现出与线粒体RNA相似的模式。

图2 血浆EVs差异RNA验证

3、差异RNA诊断能力评估（血浆+PBMC）

进一步，对于从血浆EV中筛到的6个差异指标（3个血小板来源RNA和3个线粒体来源RNA），在血浆和PBMC样本中验证进行疾病诊断性能评估（考虑循环PBMC可能是EV的来源和/或靶标）。ROC分析结果显示，在血浆样本中，差异RNA对PE诊断效果较差。而在PBMC样本中，MT-TA对PE有很好的鉴别效果。使用逻辑回归分析进行22-24周的PE风险预测，发现 PE发生风险高出15.3倍。

对于EV研究，血清和血浆样本如何选择？

目前血清和血浆是EV研究常用的循环样本。众所周知，血清是全血不加抗凝剂而自然凝固后分离出来的，不含纤维蛋白原的淡黄色液体。血小板促进血液凝固是血液凝固过程中的关键步骤，有研究发现，在凝血过程中血小板会分泌大量EVs，血清中有接近50%的EVs来源于这些额外的分泌。同时，血清凝固时会形成纤维网，从而将EVs包裹在凝血块中。这一正一反，导致血清EV与常规疾病之间的关联性低于血浆。从本研究中血浆EVs测序结果来看，很多高丰度RNA是血小板特征的RNA，这与文献报道的血小板可能是血浆EVs的主要来源结论一致。由此我们可以看出，血清和血浆EVs都含有一定比例的血小板来源EVs，这也是循环样本EVs来源异质性的一大特点。所以正常情况下，研究可优先选择血浆样本，如果研究与血小板相关的疾病的时候，血清更适合。

巧用EV全转录组数据进行EV鉴定

EV的分离和表征是非常重要的。本研究使用的商业化exoRNeasy试剂盒进行提取，未进行传统的三项鉴定（电镜观察、粒子检测、蛋白标志物Western Blot验证）。虽然目前没有已确定反映EV的RNA标志物，但研究人员根据MISEV2018指南中列出的用于验证EV的蛋白质和非EV标志物，结合本研究中的全转录组测序数据进行了验证分析，这也是一大亮点。

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