脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）衍生的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）可以反映中枢神经系统（CNS）的潜在病理特征，例如，与EV相关的补体蛋白已被证明在具有神经炎症和神经退行性疾病中升高。为了全面了解可能在AD（Alzheimer's disease）中改变的EV相关蛋白或通路，并提供关于EV在AD中的作用的新见解，需要确定AD中的CSF EV蛋白谱。

2023年4月6日，德国波恩大学研究人员在Alzheimers Dement（IF=16.655）上发表题为 “C1q is increased in cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles in Alzheimer's disease: A multi-cohort proteomics and immuno-assay validation study”的文章，通过一项多队列蛋白质组学和免疫测定验证研究发现脑脊液来源的小胞外囊泡中的C1q蛋白可以作为AD的标志物。

 研究方法

发现集：队列1和队列2，分别包括非神经退行性对照（n = 15、16）和AD患者（n = 22、20），分离CSF EV，开展Label free定量蛋白质组学。

验证集：队列3和队列4，分别包括非神经退行性对照（n = 16、43）和AD患者（n = 24、100），分离CSF EV，开展酶联免疫吸附测定（ELISA）验证潜在的候选蛋白标志物（C1q、ALDOC、CTSB）。

图1、入组样本情况

图2、研究设计思路

 研究结果

从队列1使用超速离心分离CSF EV，采用label free蛋白质组学鉴定到613 种蛋白质。队列2使用Vn96肽从CSF中亲和捕获EV，采用label free蛋白质组学鉴定到468种蛋白质，其中274种蛋白质与Cohort 1重叠。GO分析显示队列1和队列2的富集条目都与囊泡相关，表明表明这两种方法都可以有效地从CSF中分离出EV，但在蛋白质组成和已鉴定蛋白质的数量上略有不同。由于亲和纯化可能仅代表CSF中存在的总EV群体的一个子集，研究决定使用超速离心纯化的EV执行所有验证步骤。队列1蛋白的主成分分析（PCA）揭示AD患者和对照组之间的蛋白质组特征存在差异。在AD患者的CSF EV样本中，114种蛋白质发生了显著改变，其中26种蛋白质显著增加，88种蛋白质显著减少。值得注意的是，CSF EV 相关补体蛋白C1q、C1r和C1s在AD中均有所增加，上调蛋白质的GO分析也揭示补体通路激活。同样在队列2中相关补体蛋白 C1q、C1r和C1s在AD中也均有所增加，GO分析同样显示补体通路激活。

图3、蛋白质组学确定差异蛋白和通路

使用ELISA在队列3和队列4中验证补体因子 C1q，AD组的CSF EV C1q水平显著高于对照组，AUC值分别为0.7840和0.8280。当AD组被分层为MCI-AD（mild cognitive impairment）和轻度AD痴呆时，MCI中的C1q水平往往更高。此外，研究验证了另外两种CSF EV相关蛋白ALDOC和CTSB。ALDOC和CTSB以前曾与AD病理学有关。在队列3和队列4中CSF EV ALDOC和CTSB在AD中显著降低，进一步支持了蛋白质组学数据。此外，研究测量了CSF中的C1q、ALDOC和CTSB水平，发现CSF中的C1q水平在AD组中较高，ALDOC和CSTSB在AD和对照组之间没有差异。相关性分析揭示EV C1q水平和MMSE（Mini-Mental State Examination test，用作评估认知障碍）结果的显著相关性，而CSF C1q与MMSE无关。

图4、ELSIA验证差异蛋白并确定诊断效能

总结与讨论

越来越多的文献报道外泌体蛋白用于疾病标志物研究。如近期的Mol Cancer（IF=41.444）、J Hepatol（IF=30.083）、Biosens Bioelectron（IF=12.545）分别报道了血清、血浆外泌体蛋白用于结直肠肝转移、胆管癌、食管鳞癌患者的早期诊断/预后，研究利用Label free蛋白质组学的方法确定了差异候选蛋白。除了血清/血浆这些常用样本，尿液、脑脊液等体液同样可用于外泌体标志物的研究，本案例利用脑脊液外泌体开展Label free蛋白质组学确定候选蛋白标志物，用于阿尔茨海默病的诊断，并利用ELISA开展验证，为我们的外泌体蛋白标志物研究提供了非常好的研究思路。

华盈生物开发了一套完整的外泌体蛋白质组学研究技术服务体系，包含外泌体制备、外泌体鉴定、蛋白组定性定量分析、数据分析等各个环节。在外泌体制备阶段，根据客户需求，华盈生物既可以提供经典的超速离心分离服务，又可以提供脂蛋白去除效果更优的qEV尺寸排阻法分离服务。在外泌体鉴定阶段，华盈生物不仅可以提供经典的NTA分析，还可以提供准确度更高的TRPS分析。在外泌体蛋白组分析阶段，华盈生物可根据总体实验设计，提供基于标记（TMT）和非标记（Label free、DIA）的蛋白质组学方法，并在后期标志物验证阶段提供靶向蛋白组学（MRM、PRM）技术。同时华盈生物还提供后续数据的深度分析包括支持向量机，逻辑回归，随机森林算法等机器学习模型构建，竭力为广大临床科研人员提供更好的标志物研究策略和方案。