与西药在设计研发之初就有明确靶点不同，中药是人们在日常生活实践中慢慢积累和认识的，因此目前大多数中药的作用靶点不明确，严重阻碍了人们对中药作用机理的认识，同时也不利于临床合理用药。因此，中药活性成分作用靶点鉴定一直是中药研究领域的热点问题。

最近，北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室屠鹏飞/曾克武教授团队在中药药效物质及其作用机制研究上取得重大进展，在Acta Pharm Sin B（IF=14.903）、ACS Central Science（IF=18.728）发表2篇中药作用靶点文章，研究思路值得借鉴。

五味子（S. chinensis）为著名中药，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，其中五味子醇甲（Schisandrol A）是其主要药效成分，具有广泛的生物活性，尤其是其神经保护作用最为突出。然而，五味子醇甲发挥作用的直接靶点尚未完全揭示。

2022年7月，该课题组在国际学术期刊Acta Pharmaceutica Sinica B（IF=14.903）上发表题为“Schisandrol A protects AGEs-induced neuronal cells death by allosterically targeting ATP6V0d1 subunit of V-ATPase”的研究论文，深入揭示了五味子醇甲发挥神经保护作用的直接靶点及分子机制。

研究首先通过细胞实验发现五味子醇甲能够抑制神经细胞凋亡，促进线粒体Bim降解维持线粒体稳态。进一步利用Pulldown+质谱（图1A）的方法从神经细胞中鉴定到五味子醇甲直接作用靶点ATP6V0D1，随后采用Pulldown（图1B）、SPR（图1C）、MST（图1D）、CETSA（图1E）、DARTS（图1F）验证了两者的直接结合，并采用分子对接（图1G）发现五味子醇甲可以通过共价修饰TP6V0D1的335位半胱氨酸，进而促进靶蛋白变构。最后机制研究发现五味子通过调控ATP6V0D1，显著激活神经细胞中的溶酶体V-ATPase活力，进而促进溶酶体酸度提高，最终降解凋亡相关蛋白并发挥神经细胞保护作用。

图1 ATP6V0D1为五味子醇的直接作用靶点

葫芦素B（Cucurbatacin B）是瓜蒂等葫芦科清热解毒中药的主要药效成分，以葫芦素B为主要成分的葫芦素制剂临床用于湿热毒盛所致的迁延性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的治疗具有确切疗效。但葫芦素B抗肝癌的直接作用靶点至今尚未明确。

2022年5月，该课题组在国际学术期刊ACS Central Science（IF=18.728）上发表了题为“Allosteric regulation of IGF2BP1 as a novel strategy for the activation of tumor immune microenvironment”的研究论文，深入阐明了中药瓜蒂活性成分葫芦素B发挥抗肿瘤作用的分子靶点及作用机制。

研究首先通过体内外实验发现IGF2BP1（m6A reader protein）敲低能够募集肿瘤浸润性免疫细胞和阻断PD-L1的表达来产生抗肿瘤免疫抑制HCC进展。为了筛选能够抑制IGF2BP1的小分子药物，研究人员构建了一种高通量筛选系统，通过合成一个含有GG(m6A)CU序列的发生m6A修饰的单链RNA，以及一条未发生m6A修饰的对照RNA，随后加入IGF2BP1，同时加入各种小分子（先前建立的天然产物小分子库，889种化合物），采用SPR进行检测，筛选到6种候选化合物对m6A的抑制率达70%（图2A、B），其中葫芦素B展现出最佳的抑制肝癌细胞增殖的效果。

图2 筛选靶向抑制IGF2BP1的小分子

随后采用SPR（图3A）、ITC（图3B）、CETSA（图3C）、DARTS（图3D）、Pulldown+WB（图3E）进行了验证。此外，研究还采用了Pulldown+质谱同样检测到了IGF2BP1是葫芦素B结合蛋白（图3F），并采用分子对接（图3G）发现葫芦素B可以通过共价修饰IGF2BP1的253位半胱氨酸，诱导IGF2BP1蛋白变构，抑制IGF2BP1对下游m6A的识别，并且影响多个肿瘤相关靶基因的表达，发挥诱导肿瘤细胞凋亡和改善肿瘤免疫微环境的作用。

图3 IGF2BP1为葫芦素B的直接作用靶点

值得注意的是，该团队前期同样发表过多篇高水平中药小分子靶点文章，在此不做详细解析，列举了两篇以供参考。

2021年2月，该课题组在国际学术期刊Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）上发表了题为“Small molecule induces mitochondrial fusion for neuroprotection via targeting CK2 without affecting its conventional kinase activity”的研究论文，发现中药肉苁蓉活性成分松果菊苷（Echinacoside）通过不依赖于CK2经典激酶活性方式诱导线粒体融合实现神经保护，揭示了防治缺血性脑中风和血管性痴呆的关键分子靶点。

2017年7月，该课题组在国际学术期刊PNAS（IF=12.779）上发表了题为“Highly selective inhibition of IMPDH2 provides the basis of anti-neuroinflammation therapy”的研究论文，发现中药苏木活性成分苏木酮A（Sappanone A）通过对靶蛋白IMPDH2的共价修饰，进而诱导其变构失活，抑制靶点蛋白下游的多条炎症相关信号通路的激活，最终实现抗神经炎症作用，揭示了苏木酮A发挥抗神经炎症作用的分子靶点及其作用机制。

长期以来中药研究注重临床实践，而缺乏循证医学的直接实验证据，特别是药效物质和作用靶点不明确，因而难以深入揭示其治疗疾病的分子机理，严重制约了中药现代化和国际化。药物靶点是药物作用于人体最为直接、初始和重要的生物学基础，是药物发挥治疗作用的源头，因此药物靶点的揭示和阐明对于深入理解药物的作用机理至关重要。

屠鹏飞/曾克武教授课题组长期从事天然活性分子探针的发现与药物靶标鉴定，在中药药效物质及其作用机制研究上发表过一系列高水平文章，其研究思路和相关技术手段值得参考，上述研究采用Pulldown+质谱实现中药小分子的靶点筛选，进一步采用SPR、DARTS、CETSA、MST、ITC、分子对接等多种技术手段验证中药小分子与靶点的直接相互作用，为我们的很多有志于开展药靶研究却不知道如何选择相对应的技术手段提供了很好的参考。

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1）中药/复方的有效成分及代谢产物分离与鉴定；

2）血清/组织药代动力学分析

3）小分子化合物生物素批量标记

4) 小分子靶点筛选：20K芯片，DARTS，Pull down+质谱

5）药物调控信号通路筛选：磷酸化抗体芯片，蛋白质组学

6）网络药理学与计算机分子对接

7）SPR表面等离子共振（分子动力学）

|   相关文献

[1] Zhou XQ, Zhao SY, Liu TT, et al. Schisandrol A protects AGEs-induced neuronal cells death by allosterically targeting ATP6V0d1 subunit of V-ATPase. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2022, June. In press.

[2] Liu Y, Guo Q, Yang H, et al. Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment. ACS Central Science.2022，May. 2022, 8, 8, 1102–1115

[3] Zeng KW, Wang JK, Wang LC, et al. Small molecule induces mitochondrial fusion for neuroprotection via targeting CK2 without affecting its conventional kinase activity. Signal Transduct Target Ther. 2021 Feb 19;6(1):71.

[4] Liao LX, Song XM, Wang LC, et al. Highly selective inhibition of IMPDH2 provides the basis of antineuroinflammation therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jul 18;114(29):E5986-E5994.