骨肉瘤（OS）是一种常见于青少年或儿童的骨恶性肿瘤，其病理机制探索和临床治疗是全球面临的一大难题。T-复合物蛋白环复合物（TRiC，T-complex protein ring complex）对细胞内蛋白质的合成、折叠、转运、清除具有重要作用，临床样本和公共临床数据库分析结果表明，伴侣蛋白TRiC的表达量与骨肉瘤的转移和总生存率具有高相关性，表明TRiC可能是一个有前途的治疗靶点。

2022年5月，中国科学院昆明动物研究所赖仞研究员课题组在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF=14.903）发表题为“Anticarin-βshows a promising anti-osteosarcoma effect by specifically inhibiting CCT4 to impair proteostasis”的文章。该研究发现来自剧毒植物箭毒木（Antiaris toxicaria Lesch.）的天然化合物香豆素β（Anticarin-β），能够直接与伴侣蛋白TRiC的关键亚基CCT4相互作用，抑制TRiC活性，进而抑制STAT3损害蛋白质稳态，最终抑制骨肉瘤生长。

研究首先通过临床样本和公共临床数据库分析发现，伴侣蛋白TRiC的表达量与骨肉瘤的转移和总生存率具有高相关性（图1A），并且在骨肉瘤细胞增殖中起关键作用（图1B）。

图1  药物靶点TRiC的发现

为了找到TRiC的特异性靶向药物，研究人员对FDA批准的药物库进行了虚拟筛选（图2A），确定前5种可能与CCT4结合的化合物并评估他们对MG-63细胞生长的影响，发现2型糖尿病药物达格列净（Dapagliflozin）相对于其他候选药物表现出最强的抑制活性（图2B）。为了寻找更有效的抑制剂，研究人员创建了一个Dapagliflozin的三维药效团模型并筛选内部化学库，鉴定出具有药效基团与Dapagliflozin高度相似的天然化合物Anticarin-β-一种来自中药 (Antiaristoxicaria Lesch.) 树皮的小分子天然香豆素化合物（图2C）。

图2  筛选靶向TRiC的药物anticarin-β

随后，为了验证Anticarin-β对TRiC的抑制作用，研究人员通过荧光素酶实验发现Anticarin-β抑制TRiC活性（图3A），并通过SPR（图3B）和CETSA（图3C）验证了Anticarin-β与TRiC的结合，进一步通过分子对接预测了结合位点（图3D），发现结合位点突变后发现阻止了anticarin-β对U2OS 细胞的毒性（图3E），并通过ITC（Isothermal titration calorimetry）发现突变后结合能力下降（图3F）。总之，Anticarin-β通过特异性结合其CCT4亚基来抑制TRiC活性。

图3 验证anticarin-β与TRiC的靶向关系

最后，机制研究发现anticarin-β有效抑制CCT4介导的STAT3成熟和激活（图4A），阻断自噬小体和溶酶体的融合，破坏细胞蛋白稳态进而诱导凋亡（图4B）。CDX和PDX模型也显示Anticarin -β在骨肉瘤异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤功效（图4C）

图4 探究anticarin-β的作用及机制

总之，研究揭示了CCT4在骨肉瘤中的关键作用，并通过破坏CCT4和蛋白质稳态提出了一种有前途的骨肉瘤治疗策略（图5）。

图5 Anticarin-β抑制骨肉瘤生长机制模式图

对于我们开展药物研究，一般有两种情况：1）在知道药物疗效的情况下寻找药物靶点，2）在知道疾病靶点的情况下寻找药物；该案例属于后者，为我们提供了一个很好的研究思路。

1）研究首先通过公共临床数据库和临床样本发现TRiC蛋白与骨肉瘤密切相关，并验证了TRiC蛋白的促肿瘤作用，表明它可能是一个很好的药物靶点。对于我们大部分科研工作者来说，我们手头或多或少有这样的一个与疾病相关的蛋白，没有的话，数据库或组学方法筛选也是不错的选择。

2）找到药物靶点以后，寻找药物的直接作用靶点，并探究靶点相关的机制是拔高研究档次的方法。该研究通过虚拟筛选的方法发现了靶向TRiC蛋白的药物，并基于药效基团进行了改进，发现了更有效的抑制剂天然化合物Anticarin-β。

3）在找到靶向药物Anticarin-β以后，需要做的是验证药物和靶点之间的靶向关系，这个时候，有多种方法可以选择，研究中采用了荧光素酶实验、SPR、CETSA、ITC、分子对接的方法，其他DARTS，Pull down+质谱等方法同样适用。

4）研究最后需要做的是发现靶点的作用及相关信号通路等，该研究发现Anticarin-β抑制STAT3成熟和激活，破坏细胞蛋白稳态进而诱导凋亡，也利用CDX和PDX模型发现Anticarin -β的抗肿瘤功效。

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