苦参酮是中药苦参的主要活性成分，常用于治疗腹泻、细菌和真菌感染、湿疹和炎症相关疾病，其对帕金森病（PD）是否有疗效尚不清楚。

2022年3月1日，该团队在PNAS（IF=11.205）发表研究，发现中药苦参活性成分苦参酮在PD中发挥治疗效果并揭示其直接作用靶点及机制。

研究发现苦参提取物在MPTP诱导的小鼠PD模型中显示出减轻PD作用，进一步采用质谱分析苦参提取物处理20min后的小鼠大脑组织和血浆代谢物发现kushenols F、N、 S、flemiphilippinin D、sophoraflavanone G和kurarinone 6种分子显著改变。文献报道kurarinone是苦参提取物的主要组分，故选取kurarinone进行PD治疗作用评估（图1A），发现kurarinone改善MPTP引起的PD小鼠的步态障碍和神经毒性（图1B、C），增强MPTP诱导的PD小鼠的TH表达和神经递质水平（图1D），逆转MPTP诱导的神经炎症和小胶质细胞的激活（图1E）。

图1

研究人员采用热蛋白质组分析（TPP，thermal proteome profiling）和溶剂诱导的蛋白质沉淀（SIP，solvent-induced proteinprecipitation）方法筛选kurarinone的潜在靶点（图2A）。对TPP和SIP共同鉴定到的3245种蛋白质进行了定量，包括sEH（基因名Ephx2）在内的14种蛋白质被确定为kurarinone的候选靶点（图2B、C），GO分析显示这些蛋白参与炎症反应在内的细胞过程。鉴于文献报道sEH在PD引起的神经炎症中发挥作用，研究人员采用Western blot进行了验证，发现随着温度和溶剂混合物百分比的升高，kurarinone处理组中的sEH逐渐降低，而对照组中的sEH 迅速下降，表明sEH是kurarinone的潜在靶蛋白（图2D）。

图2

随后，研究人员通过体外活性抑制实验发现kurarinone对sEH表现出剂量依赖性抑制作用（图3A），通过表面等离子共振 (SPR) 技术发现苦参酮能够以剂量依赖性方式增加其与sEH 的结合（图3B），通过共结晶证实kurarinone 分别与氨基酸残基 Tyr343、Ile363、Gln384 和 Asn472 和 OH-7、OH-20、OH-40 和 C-4 处的羰基形成四个常规的氢键相互作用（图3C）。

图3

图4

天然产物紫草素（SHK）是一种紫草的生物活性成分，具有多种生理和药理作用特性，包括抗炎、伤口愈合和抗癌症等。然而其对结肠癌的作用及背后的机制尚未被研究。

2022年3月9日，该团队在Signal Transduct Target Ther（IF=18.187）发表研究，发现中药紫草活性成分SHK在结直肠癌中发挥治疗效果并揭示其直接作用靶点及机制。

研究首先通过细胞实验和动物实验发现SHK（结构见图5A）能够抑制结直肠癌细胞增殖（图5B），抑制结直肠癌小鼠肿瘤生长（图5D），并抑制炎症因子分泌（图5C、E），表明SHK能够在体内和体外下调炎症信号通路进而抑制结直肠癌进展。

图5

研究人员采用TPP和SIP方法来揭示SHK的潜在靶点（图6A）。对TPP和SIP共同鉴定到的2269种蛋白质进行了定量，包括PRDX5、NEMO在内的22种蛋白质被确定为SHK的候选目标（图6B、6C），GO分析其中的PRDX5、NEMO参与炎症反应过程（图6D），IKKβ虽然没有被质谱打出，但已被报道能够与NEMO形成复合物调控NF-kB通路。于是研究人员通过Western blot进行了验证，发现随着温度和溶剂混合物百分比的升高，SHK处理加速了NEMO以及IKKβ蛋白对温度或溶剂变化的沉淀，表明NEMO、IKKβ是SHK的作用靶点（图6E、6F），而PRDX5也被质谱打到且与炎症相关，但WB实验发现SHK处理不能引起PRDX5下游NRF-2和HO1信号的改变，故将其排除。

图6

NEMO/IKKΒ被报道是负责IκB磷酸化的亚基，随后释放游离的NF-κB二聚体（p50和p65亚基）进入细胞核以促进促炎基因的转录。研究人员发现SHK以剂量依赖性方式抑制IKKβ的磷酸化和激酶活性，降低p-IκB-α的蛋白质水平（图7A），SHK处理后也观察到对NF-κB荧光素酶活性的显著抑制（图7B、7C），减少p50/p65亚基向细胞核的易位（图7D、7E）。表明SHK破坏癌细胞中的 IKKβ-NEMO 相互作用抑制炎症通路。

图7

研究人员最后通过co-IP（图8A）、Pull-down（图8B）、SPR（图8C）、体外活性抑制实验（图8D）、共结晶实验（图8E）、分子对接（图8F）分别验证了紫草素能够与NEMO/IKKΒ结合，并发现SHK与NEMO/IKKΒ复合物的重要结合域结合，包括D738（IKKβ）、M94和R101（NEMO）形成四个氢键，在相互作用界面外与Q98（NEMO）形成两个氢键，用丙氨酸替换D738、W739、W741 或M94/Q98/R101（三点共突变）阻止了NEMO/IKKβ复合物的形成。

图8

两篇文章采用了相似的研究思路和研究手段：

第一步，发现中药活性单体对改善疾病。通过细胞实验、动物实验发现中药活性单体改善疾病表型，并且影响疾病相关的生物学过程，如炎症反应等；

第二步，筛选中药活性单体的作用靶点。通过TPP和SIP方法揭示SHK的靶点并进行筛选和验证；（达吉特可提供其他筛选策略，如20K人类蛋白组芯片、Pulldown+质谱等）

第三步，研究靶点下游的表型相关通路。通过细胞实验、动物实验发现将靶点敲除以后药物不再发挥治疗作用，且疾病表型相关的信号通路如炎症通路发生改变。

第四步，挖掘中药活性单体与靶点的结合形式。通过co-IP、Pull-down、SPR、体外活性抑制实验、共结晶实验、分子对接等实验全面验证了中药活性单体与靶点的结合。

总之，该研究为我们开展中药小分子研究提供了一个值得借鉴的思路，其中找到中药活性单体的作用靶点并进行验证是两篇文章发表在高分杂志上的关键。

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1）中药/复方的有效成分及代谢产物分离与鉴定；

2）血清/组织药代动力学分析

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4) 小分子靶点筛选：20K芯片，IP/Pull down+质谱

5）药物调控信号通路筛选：磷酸化抗体芯片，蛋白质组学

6）网络药理学与计算机分子对接

7）SPR表面等离子共振（分子动力学）

 

|   相关文献

[1] Cheng-Peng Sun, Jun-Jun Zhou, Zhen-Long Yu,et al. Kurarinone alleviated Parkinson's disease via stabilization of epoxyeicosatrienoic acids in animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022.119(9):e2118818119.

[2] Zhenlong Yu, Jian Gao, Xiaolei Zhang,et al. Characterization of a small-molecule inhibitor targeting NEMO/IKKβ to suppress colorectal cancer growth. Signal Transduct Target Ther. 2022.7(1):71.

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