图1 SARS-CoV-2病毒通过 ACE2 受体进入多个器官

—BMJ. 2021;374:n1648

如何治疗COVID-19代谢并发症呢？中山大学等相关单位为我们提供了解决方案！

2022年2月，中山大学孙逸仙纪念医院陈思凡、严励团队，中山大学附属第一医院李梓伦、中山大学中山医学院邓凯教授及国家超算广州中心等单位联合在Cell Metab（IF=27.287）上发表题为“Imatinib and methazolamide ameliorate COVID-19-induced metabolic complications via elevating ACE2 enzymatic activity and inhibiting viral entry”的研究论文¹，发现ACE2通路下调是新冠肺炎导致的糖尿病等代谢并发症的关键机制，并鉴定出新的ACE2酶活激动剂，为新冠诱发的代谢并发症防治提供了新的潜在治疗药物。

那么他们是如何一步一步发现COVID-19代谢并发症的治疗药物的呢？要想找到COVID-19代谢并发症的治疗药物，必须先找到药物靶点。

研究人员通过比较正常与感染的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 的转录组数据，发现病毒感染富集“糖尿病”和“糖酵解/糖异生”，以及与病毒感染相关的途径（图1A、B），基于这些研究人员猜测SARS-CoV-2可能会影响与代谢并发症相关的基因表达。鉴于高血糖、高血压、肾小球损伤、内皮功能障碍和血栓形成是COVID-19患者的主要代谢缺陷，并具有与糖尿病、高血压、糖尿病肾病和动脉粥样硬化相似的症状，研究人员推测这四种疾病共有的基因可能是COVID-19相关代谢疾病发病过程的核心基因。于是从DisGeNET和Open Target数据库选择了四种代谢疾病中排名的前400的基因，在两个选择的数据库中四种疾病分别共享了48个和72个基因，取交集后发现共享了20个基因（图1C）。研究人员推测这20个基因可能在COVID-19相关代谢疾病的发病过程中发挥核心作用，通过比较这20个基因在转录组和SARS-CoV-2感染的类器官和细胞中的表达，发现ACE2是不同转录组数据集中病毒感染后持续抑制最显著的基因（图1D），表明ACE2可能是连接SARS-CoV-2感染与其继发性代谢缺陷的重要枢纽。

转录组学结合数据库筛选发现ACE2

由此，研究人员通过转录组学结合数据库筛选发现ACE2在COVID-19感染导致代谢失调中的核心作用。

接着研究人员通过细胞、动物、临床样本验证ACE2在COVID-19感染导致的代谢失调中的作用。如SARS-CoV-2感染了HUVEC，发现感染后ACE2 mRNA和蛋白质显著降低（图2A、2B），且感染SARS CoV-2后7天的饮食诱导肥胖的hACE2转基因小鼠的肝脏和肾脏中ACE2 mRNA也显著下降（图2C、2D），HUVEC中敲低ACE2的表达显著上调炎症因子TNF-a、IL-6的表达（图2E），在ob/ob小鼠中过表达ACE2，显著降低炎症因子TNF-a、IL-6的表达（图2F、2G），改善肥胖小鼠葡萄糖和脂质代谢紊乱（图2H），改善肝脏脂肪变性（图2I），肾小球损伤（图2J），改善受损的左心室射血分数和缩短分数（图2K）。

图3 细胞、动物、临床样本验证ACE2的差异表达及作用

在找到COVID-19代谢并发症的治疗靶点并验证了靶点的作用以后，至关重要的一步来了，那就是如何针对ACE2来开发针对性的药物呢？

前面已经验证ACE2通路受损可能是导致SARS-CoV-2相关代谢缺陷的关键因素，那么恢复ACE2的表达或活性可能是治疗COVID-19相关代谢紊乱的一种新的有效策略。

于是研究人员通过使用2种方法来识别潜在激活剂，(1) 酶激活剂，化合物直接与ACE2结合以增强其酶促活性，(2) 转录激活剂，化合物可增加ACE2的表达。InterBioScreen和Drug Bank数据库（共76,639种化合物）通过天河二号超级计算机进行的虚拟对接筛选，选择了924种具有直接结合和激活潜力的化合物。同时利用CMAP生物信息学数据库，筛选出83个潜在的ACE2转录激活剂。结合新冠病毒感染所导致的转录组变化，及后续ACE2下游基因表达的实验验证，最终鉴定出伊马替尼（imatinib）、醋甲唑胺（methazolamide）及哈巴俄苷（harpagoside）这三种可能改善新冠病毒感染的新型ACE2酶活激动剂（图3）。

图4 ACE2激动剂的高通量筛选策略

通过上述策略研究人员找到了伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺这三种化合物可以激活ACE2激动剂，作为COVID-19代谢并发症治疗药物。

接下来，研究人员对三种药物的作用机制进行验证，即它们是否通过与ACE2的直接结合发挥作用。

通过使用Biacore分析发现，伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺结合到ACE2蛋白的Kd值分别为12.7、86.1和70.0 mM，而氧杂蒽酮（Xanthone）作为阴性对照不能与ACE2结合（图4A）。随后通过分子对接对伊马替尼或醋甲唑胺与ACE2蛋白/氨基酸结构结合进行了分子动力学模拟（图4B）。使用伊马替尼、哈巴俄苷或醋甲唑胺处理HUVECs后，ACE2酶活性显著提高，而ACE2的酶抑制剂 (DX600) 显示出相反的效果（图4C）。最后，伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺有效增加AML12细胞中ACE2的mRNA水平（图4D）。结果表明，伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺可通过与ACE2的直接结合激活ACE2。

图5 ACE2激动剂与ACE的直接相互作用关系验证

由于伊马替尼和醋甲唑胺已经商业化用于临床治疗，因此更容易重新利用这两种药物用于 COVID-19相关代谢疾病的治疗，于是研究人员对这两种药物的疗效进行了验证。

研究人员使用伊马替尼或醋甲唑胺治疗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠并监测全身代谢，发现伊马替尼或醋甲唑胺干预后直接激活ACE2通路改善胰岛素抵抗小鼠的代谢缺陷（图5A）。为进一步阐明伊马替尼和醋甲唑胺对SARS-CoV-2感染的调节作用，研究人员采用hACE2转基因小鼠进行饮食诱导肥胖后服用伊马替尼或醋甲唑胺，然后感染SARS-CoV-2，发现马替尼和醋甲唑胺恢复了ACE2酶活性改善了胰岛素抵抗小鼠中由SARS-CoV-2感染引起的代谢缺陷（图5B），同时还减轻了小鼠肺部炎症，降低病毒载量。最后，通过体外实验，研究人员证实ACE2激动剂是通过改变ACE2的蛋白构象，降低其与病毒刺突糖蛋白的结合，从而有效抑制病毒入侵（图5C）。

图6 ACE2激动剂改善COVID-19感染导致的代谢失调的药理学作用

最终结果表明，筛选到的两种ACE2激动剂可以充当COVID-19代谢并发症治疗药物。

那么该研究对于我们广大的有志于药物开发的朋友们有什么启示呢？

我们总结了一下该研究的思路：

1）转录组学结合数据库筛选发现ACE2在COVID-19感染导致代谢失调的核心作用；

2）细胞和小鼠实验验证ACE2通路的下调可能是新冠病毒感染引发代谢障碍的关键；

3）通过高通量分子对接筛选结合Biacore验证，鉴定出伊马替尼、醋甲唑胺和哈巴俄苷能直接结合并激活ACE2；

4）在胰岛素抵抗小鼠中，伊马替尼和醋甲唑胺通过激活ACE2有效改善代谢紊乱，并减轻新冠病毒感染引发的糖脂代谢紊乱、肺部炎症和病毒载量；

5）这3种化合物通过抑制ACE2与病毒S蛋白结合，减少病毒对细胞的入侵。

值得注意的是，筛选并验证伊马替尼、醋甲唑胺和哈巴俄苷能直接结合并激活ACE2无疑是该研究的核心环节，研究利用基于结构的虚拟筛选技术从小分子化合物的药物分子库中筛选出能与ACE2结合并潜在激活ACE2的小分子化合物，并利用Biacore分析验证它们的直接结合的思路可应用于各类疾病的小分子药物研发，大大提高研发效率并减少经济成本。

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