2022年2月，四川大学华西第二医院曹中炜和丁楅森教授团队在J Hepatology（IF=25.083）上发表题为“Dopamine receptor D2 antagonism normalizes profibrotic macrophage-endothelial crosstalk in non-alcoholic steatohepatitis”的研究成果【1】，发现在小鼠和猪的动物模型中，多巴胺受体D2（DRD2）拮抗剂可选择性阻断巨噬细胞中的Hippo/YAP通路减轻肝纤维化。

研究人员首先在肝硬化病人的肝脏样本和CCl4诱发的肝纤维化小鼠中发现，巨噬细胞YAP蛋白表达显著增加（图1A、B），通过构建慢性肝损伤模型发现巨噬细胞YAP水平随肝纤维化程度的严重性而逐步上升（图1C、D），表明巨噬细胞YAP的高表达可能是肝纤维化的促成因素。进一步研究人员利用骨髓特异性YAP敲除小鼠构建慢性肝损伤模型，与野生型相比，YAP敲除鼠在造模后肝纤维化显著减少（图1E），在NASH模型中，同样发现YAP敲除鼠的肝纤维化减少（图1F），表明巨噬细胞YAP缺失会阻碍慢性肝损伤或NASH模型中的肝纤维化进程。

图2 YAP缺陷型巨噬细胞和EC互作影响肝纤维化

由于GPCR信号调节YAP激活，研究人员着手确定可以选择性阻断纤维化YAP的靶向GPCR的疗法。通过从MCE (MedChemExpress Inc.)获取GPCR/G protein compound library（采用DMSO溶解为10 mM的489种化合物），采用HEK293T细胞进行体外筛选，合成YAP/TAZ响应启动子并克隆 pGL3载体中以构建8x GTIIC-Luc报告基因，转染到HEK293T细胞中培养24h，根据萤光素酶测定系统（Promega）检测荧光强度。结果发现13种化合物可改变YAP活性，其中的氟奋乃静二盐酸盐（Flu，Fluphenazine dihydrochloride）是一种多巴胺受体2（DRD2）拮抗剂，是降低YAP活性的最强药物之一（图3A）。此外，Flu能够降低再体外降低巨噬细胞而非HepG2肝细胞中的YAP反应信号（图3B）。Flu治疗增加了YAP磷酸化（图3C）。在巨噬细胞中，敲低DRD2增强YAP的磷酸化（图3D）。这些数据表明拮抗DRD2可以增强巨噬细胞YAP磷酸化来抑制其活性。

图3 GPCR配体库筛选鉴定拮抗巨噬细胞中YAP的化合物

研究者对来自髓系Drd2缺陷或对照小鼠的分离巨噬细胞进行RNA测序，KEGG富集途径分析显示 Hippo/YAP信号传导与巨噬细胞中的DRD2功能显著相关（图4A，B）。I 型干扰素信号相关基因，包括 Ifnb1、Ifi27I2a、Ifi44和Isg15，在缺乏骨髓 DRD2 和YAP的两只小鼠中都上调（图4C）。类似于YAP缺失，髓系Drd2 缺失也可以上调 IFN-β 表达，抑制 ECs中的CTGF和VCAM1表达（图4D）。骨髓 DRD2 或YAP缺失后可以增强肝细胞增殖（图4E），表明Drd2或Yap1的骨髓特异性缺失通过引发I型IFN信号传导促进肝再生而不是纤维化。最后，研究人员在猪的NASH模型中测试了Flu的治疗效果，发现与对照组相比，Flu治疗组的肝纤维化程度较低（图4F），此外，Flu治疗显著促进了NASH小型猪肝脏中的肝细胞增殖（图4G）。来自这种临床相关大型动物模型的数据支持 DRD2 拮抗剂在NASH等疾病中促进肝再生而不是纤维化的治疗价值。

图4 靶向DRD2/YAP轴抑制肝纤维化

总之，该研究发现YAP的骨髓特异性缺失通过I型干扰素信号传导减弱肝纤维化，且YAP的骨髓特异性缺失影响巨噬细胞和内皮细胞之间的互作减弱肝纤维化，而DRD2拮抗剂可选择性靶向巨噬细胞中YAP，在小鼠和猪动物模型中阻断肝纤维化（图5）。

图5 DRD2拮抗剂阻断YAP减轻肝纤维化

该研究从已有的明星分子YAP着手，从动物实验和临床样本验证巨噬细胞中YAP蛋白的上调，随后深入机制研究发现抑制巨噬细胞YAP可通过I型干扰素信号传导减弱肝纤维化，且抑制巨噬细胞YAP影响巨噬细胞和内皮细胞之间的互作进而减弱肝纤维化。接着使用高通量GPCR配体库筛选到拮抗巨噬细胞中YAP的化合物Flu，并验证了Flu药理作用，为我们呈现了一套完整的从表型发现，机制研究，药物筛选，药效验证的流程。其中的药物筛选过程是发表高分文章的核心步骤，即在挖掘清楚疾病的发病机制后，需要做找到解决办法，筛选相关药物来实现对疾病发病相关途径的调控，最终实现改善疾病的目的。

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[1] Qing J, Ren YF, Zhang YW, et al. Dopamine receptor D2 antagonism normalizes profibrotic macrophage-endothelial crosstalk in non-alcoholic steatohepatitis[J].J Hepatol.2022,76(2):394-406.

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