肺结核被列为引发全球人口死亡的十大原因之一，每年造成全球约170万人死亡。最近在非洲和亚洲的流行率调查显示，多达三分之一的活动性肺结核（ATB）患者未被确诊，因而未得到治疗，迫切需要改进诊断方法，以便发现、治疗从而减轻活动性肺结核的巨大全球健康负担。近日来自哈佛大学和麻省理工学院Broad研究院等研究机构的研究人员，应用Luminex平台和Simoa超高灵敏蛋白检测技术，开发出一种基于血液的检测方法可用于诊断活动性结核病，相关研究发表在最新一期国际顶级期刊《Science Translational Medicine》上，PMID: 31645455。

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研究机构：哈佛大学和麻省理工学院Broad研究院、哈佛医学院布列根和妇女医院等

目前结核病的检测技术是对病人的痰液进行显微镜检查，并用Ziehl-Neelsen抗酸染色的技术，这种方法灵敏度不足且依赖于操作人员技术，并且固体或液体培养方法缓慢，对实验室基础设施有要求，限制了在结核病高发但资源有限的环境中使用。此外，两个最脆弱和受影响最大的群体，即感染艾滋病毒的儿童和成人，由于难以获得痰液且样本中的细菌含量低，不太可能用痰液来诊断。一些商业血液检测试剂试图填补这一空白，但有证据表明这些检测准确度不高，世界卫生组织强烈建议不要使用这些商业化检测试剂盒用于诊断肺结核。因此目前急需一种快速、简单、低成本、高灵敏度的诊断方法。

Verification Cohort：利用Simoa技术对317例双盲血液样品进行诊断模型验证和评估蛋白标注物性能，从而区分活动性结核病和其他结核病相似类的疾病。

2、 基于超高灵敏检测Simoa技术改进ATB诊断模型

结果发现ATB的蛋白质浓度显著高于OTD和治愈对照组，ATB中IL-6的平均浓度约为OTD的4倍。19个治愈对照组的IL-6平均浓度远低于ATB组。ATB与OTD患者相差2.4倍。IL-8和VEGF的表达模式相似（图1）。研究人员表示，如预期的那样，与Luminex技术相比，Simoa对每种分析物的分析灵敏度高出几个数量级，在很大程度上消除了最初Discovery Cohort的缺失值问题，并有可能实现通过指尖获得的血量进行检测。

图1 Simoa检测的标志物蛋白浓度连续分布情况——Discovery Cohort

由于Simoa超高灵敏度改变了血浆蛋白的检测阈值，可以获得全动态值范围的连续性检测数据，利用TreeNet机器学习算法与Simoa衍生数据集重新进行10倍交叉验证，结果显著改善了ATB诊断模型的性能：交叉验证准确度为0.85（ROC-AUC），敏感性为87%，特异性为66%（表1c、图2）。

3、 ATB分类算法的验证

为了验证该诊断模型并评估其性能，利用Simoa技术，使用来自三个国家的317例完全独立的双盲实验收集的临床血液样本评估了四种蛋白标志物。与Discovery Cohort一样，Validation Cohort阶段的ATB组、OTD组和治愈对照组的IL-6、IL-18和VEGF浓度存在显著差异（图3）。TreeNet算法的准确度（ROC-AUC）为0.80，敏感性为80%，特异性65%（表2C），所有数据均有超高灵敏技术Simoa获得。

图3 Simoa检测的标志物蛋白浓度连续分布情况——Verification Cohort

从本项研究中，我们不难看出，标志物研究一般分为Discovery Cohort、Validation Cohort和Verification Cohort三个阶段，每个阶段主要研究目标各有侧重。在Discovery Cohort阶段，研究人员一般需要有高通量的检测手段，以尽可能大范围进行筛选，发现潜在的分子标志物；在Validation Cohort阶段，研究人员期望通过中通量的手段，在大批量样品中进行潜在分子标志物的确证，并建立诊断模型。在Verification Cohort阶段，需要通过随机双盲对照实验及多中心协作的方式，以确认Validation Cohort阶段的诊断模型确有显著的诊断效能，并加以优化，在这个阶段，获得连续性的检测数据，对于诊断模型的优化至关重要。

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英文链接：https://stm.sciencemag.org/content/11/515/eaaw8287.short