免疫检查点疗法（immune checkpoint blockade，ICB）已经在肿瘤疾病中得到了广泛应用，但部分患者依然出现低应答甚至不应答的现象。因此开发新型免疫疗法是解决患者低响应的关键。aPD-L1+aCTLA4联合治疗是目前研究最广泛的联合疗法之一，在部分疾病中联合治疗患者显示出了更好的临床结局，但联合治疗的细胞机制依然未知。

来自比利时鲁汶大学的研究团队在《Immunity》（IF=32.4）发表的一项题为“CD4+ T cell activation distinguishes response to anti-PD-L1+anti-CTLA4 therapy from anti-PD-L1 monotherapy”的研究，使用单细胞测序、空间转录组和PCF空间单细胞蛋白组（PhenoCycler-Fusion，原CODEX）对头颈癌患者的肿瘤免疫微环境进行了检测，发现了头颈癌患者接受免疫联合治疗时的早期响应标志。

为了评估免疫治疗和联合治疗对患者免疫微环境的影响，研究人员首先使用单细胞测序（scRNA-seq）对患者肿瘤组织进行了免疫细胞分析。作者分别分析了4种CD8+ T细胞亚型和5种CD4+ T细胞亚型。结果显示接受了aPD-L1治疗的患者体内多个CD8+T细胞亚群出现上调，而CD4+T细胞没有出现扩增。但在aPD-L1+aCTLA4联合治疗的患者中即便CD8+T细胞出现了相同的扩增情况，但CD4+T细胞比例相较于aPD-L1治疗更高（图1）。

图1 aPD-L1治疗和aPD-L1+aCTLA4联合治疗的免疫微环境

为了进一步研究免疫治疗的细胞机制，研究人员使用PhenoCycler-Fusion对两种疗法的患者肿瘤组织切片进行了分析。分别使用Ki67/CD3e/CD8和Ki67/CD3e/CD4来定义治疗后出现扩增的CD4+T细胞和CD8+T细胞。空间单细胞蛋白组结果显示，相比于aPD-L1治疗，联合治疗的患者肿瘤组织中扩增的CD4+T细胞和CD8+T细胞出现了更多的共定位（图2A-B）。同时研究人员还分析了Th1、CD8+Tem、和Tex细胞的标志物，发现以上细胞的标志物主要分布在CD4+T细胞和CD8+T细胞的共定位区域，这个结果也验证了scRNA-seq的发现（图2C）。空间单细胞蛋白组技术阐述了T细胞扩增的空间特征，即在联合治疗时，CD4+T细胞也会出现扩增，且在空间位置上与CD8+T细胞邻近。

图2 空间单细胞蛋白组显示T细胞扩增区域空间特征

研究人员通过单细胞测序分析了与T细胞扩增相关的通路，发现T细胞活化、细胞毒性和MHC I型抗原呈递相关基因部分上调（图3A）。研究人员猜测T细胞和髓系细胞可能存在联系，空间转录组分析显示，在T细胞相关基因高表达区域同时含有较高的髓系细胞基因（图3B）。接下来研究人员使用空间单细胞蛋白组验证髓系细胞与T细胞的共定位，结果显示在含有扩增T细胞的区域内，髓系细胞出现的频率较高。同时研究人员还分析了扩增T细胞与浆细胞的空间位置，发现两者也出现了共定位的现象（图3C）。这种空间上的关系预示着细胞间可能存在互作，研究人员通过相关性分析发现，表达抗原呈递和T细胞归巢基因的DC与T细胞扩增相关，同时T细胞扩增与IgG+浆细胞的扩增相关（图3D）。

图3 多组学分析扩增T细胞区域内细胞空间位置

最后研究人员分析了肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和肿瘤组织中T细胞的变化情况，接受治疗的患者的tdLNs中T细胞主要由初始/中央记忆CD4+T细胞组成，而肿瘤中主要以效应T细胞为主（图4A-B）。研究人员接着对两种疗法患者的肿瘤和tdLNs的TCR-seq（T细胞抗原受体）数据进行了分析，发现了在aPD-L1+aCTLA4治疗时tdLNs部位的初始/中央记忆CD4+T细胞会被招募，并进行分化和扩增，从而转变为效应T细胞实现对肿瘤细胞的杀伤（图4C），而aPD-L1治疗患者肿瘤部位效应T细胞的含量则相对较少，这也是联合治疗对肿瘤杀伤效果更好的原因之一。

图4 联合治疗tdLNs和肿瘤部位T细胞的变化情况

本研究通过多组学分析头颈癌患者免疫治疗前后的肿瘤样本，揭示了aPD-L1+aCTLA4联合治疗增强T细胞扩增的细胞机制，描绘了联合治疗中头颈癌患者免疫微环境的空间状态。最终确定了CD4+T细胞的激活以及肿瘤引流淋巴结部位T细胞的招募是头颈癌免疫联合治疗早期响应的标志。

PCF空间单细胞蛋白组：组织空间分析的革新