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STTT(IF=39.3):老药新用——抗过敏药地氯雷他定作用于肝癌的靶点机制研究

STTT(IF=39.3):老药新用——抗过敏药地氯雷他定作用于肝癌的靶点机制研究

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小王
  • 来源:达吉特公众号

【概要描述】抗过敏药地氯雷他定抗肝癌靶点与机制研究

STTT(IF=39.3):老药新用——抗过敏药地氯雷他定作用于肝癌的靶点机制研究

【概要描述】抗过敏药地氯雷他定抗肝癌靶点与机制研究

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小王
  • 来源:达吉特公众号
  • 发布时间:2023-12-06 15:41
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地氯雷他定(desloratadin)是一种H1受体拮抗剂,抗过敏作用强,一般用于荨麻疹及过敏性鼻炎。2023年1月广州医科大学李斌团队在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF=39.3)杂志发表题为“Blockade of NMT1 enzymatic activity inhibits N-myristoylation of VILIP3 protein and suppresses liver cancer progression”的论文,他们的研究表明地氯雷他定通过与靶蛋白肉豆蔻酰基转移酶1(NMT1)结合,抑制NMT1的酶活性,导致下游NF-κB通路被抑制,从而发挥抗肝癌作用。

|   01、地氯雷他定在体内外对肝癌细胞增殖和生长的抑制作用

研究者首先基于由FDA批准的419种药物组成的药库,检测其对肝癌细胞增值的抑制作用,再从中选出文献报道较少且抗肝癌细胞增殖作用强的地氯雷他定(图1A-C),接着对其抗肝癌作用在细胞水平和动物移植瘤层面上进行了验证(图1D-E)。发现地氯雷他定在体内外均能抑制肝癌的增殖。

图1 地氯雷他定在体内外对肝癌细胞增殖和生长的抑制作用

|   02、地氯雷他定直接结合NMT1

研究者为了探索地氯雷他定发挥抗癌生物活性的分子机制,进行了DARTS实验质谱分析(图2A),在候选蛋白中,选择了5种感兴趣的蛋白修饰酶进行进一步研究。分别敲低这五种蛋白,发现只有敲除NMT1降低了肝癌细胞对地氯雷他定的敏感性(图2B)。此外,他们发现NMT1高表达的肝癌患者的生存期显著缩短(图2C),敲低NMT1抑制了肝癌细胞的增殖(图2D),过表达NMT1促进了肝细胞癌移植瘤的增长(图2E)。

图2 地氯雷他定直接结合NMT1

|   03、地氯雷他定与NMT1蛋白ASN-246位点的结合是其抗癌活性所必需的

SPR实验验证了地氯雷他定与NMT1的结合(图3A),接着为了进一步确定地氯雷他定在NMT1中的结合部位,研究者使用分子对接找到地氯雷他定与NMT1蛋白的4个可能结合位点(图3B)。研究者分检测敲除NMT1后再分别表达四个位点突变的NMT1蛋白对肝癌细胞增殖的影响,发现只有ASN-246位点突变后,细胞活力得到恢复。接着研究者纯化了ASN-246位点突变的NMT1蛋白(图3D)。SPR分析证实了ASN-246位点突变的NMT1蛋白与地氯雷他定的结合亲和力低于野生型NMT1蛋白 (图3E)。上述结果表明地氯雷他定通过靶向NMT1蛋白的ASN-246位点抑制肝癌的进展。

图3 地氯雷他定通过靶向NMT1蛋白的ASN-246位点抑制肝癌的进展

|   04、地氯雷他定抑制NMT1介导VILIP3蛋白的肉豆蔻酰化

酶活检测发现地氯雷他定能显著抑制NMT1的肉豆蔻酰化酶活性(图4A)。研究者使用代谢标记实验鉴定了地氯雷他定显著下调的被NMT1介导的肉豆蔻酰化蛋白底物 (图4B)。罗丹明荧光和考马斯亮蓝染色证实,地氯雷他定显著降低了肝癌细胞内蛋白质的肉豆蔻酰化水平(图4C)。质谱分析鉴定出291种蛋白质在炔基肉豆蔻酸(ALK-12)组中存在,但在对照组或地氯雷他定处理组中不存在(图4D)。由于NMT1蛋白对N末端氨基酸序列为GxxxS的蛋白质显示出较强的识别能力,作者根据这些标准选择了三种蛋白质VILIP3、PPM1G和FAM129A (图4E)。WB结果显示地氯雷他定对VILIP3蛋白N-肉豆蔻酰化水平具有显著抑制作用(图4F)。接下来,作者构建了N端甘氨酸突变为丙氨酸的VILIP3mut质粒,并在VILIP3基因敲除细胞中重新表达。VILIP3基因敲除显著降低了肝癌细胞对地氯雷他定的敏感性,这种作用可通过过表达VILIP3wt而不是VILIP3mut来取消(图4G)。

图4 地氯雷他定抑制NMT1介导VILIP3蛋白的肉豆蔻酰化

|   05、地氯雷他定促进VILIP3蛋白降解抑制NF-κB信号通路

研究者发现地氯雷他定对VILP3的mRNA表达无明显影响(图5A),但能显著抑制其蛋白表达(图5B),CHX实验表明地氯雷他定显著促进了VILIP3蛋白的降解(图5C)。随后研究者使用RNA-seq实验找到下游NF-κB信号通路(图5D)。地氯雷他定对NF-κB途径的抑制作用能通过敲除VILP3来逆转,且只有过表达野生型的VILP3能部分恢复其抑制作用。

图5 地氯雷他定促进VILIP3蛋白降解抑制NF-κB信号通路

|   总结与讨论

本研究首先在细胞水平从FDA批准的药库中筛到抗肝癌药物地氯雷他定,接着使用DARTS技术加质谱分析找到靶点NMT1,然后炔基肉豆蔻酸加点击化学的方法找到下游VILIP3,接着通过RNA-seq的方法找到下游通路,后续做了rescue实验进行验证。在机制上,地氯雷他定与NMT1的ASN246位点结合并抑制其酶活性,破坏NMT1介导的VILIP3蛋白的肉豆蔻基化和随后的NF-κB/Bcl2信号转导,从而抑制肝癌的发生发展。

图6 地氯雷他定抑制NMT1酶活性和肿瘤形成的示意图

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4) 小分子靶点筛选:20K芯片,DARTS/Pull down+质谱

5)药物调控信号通路筛选:磷酸化抗体芯片,蛋白质组学

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8)天然产物化合物库与功能化合物筛选服务

|   相关文献

Tan XP, He Y, Yang J, Wei X, Fan YL, Zhang GG, Zhu YD, Li ZQ, Liao HX, Qin DJ, Guan XY, Li B. Blockade of NMT1 enzymatic activity inhibits N-myristoylation of VILIP3 protein and suppresses liver cancer progression. Signal Transduct Target Ther. 2023 Jan 9;8(1):14. doi: 10.1038/s41392-022-01248-9.

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