地氯雷他定（desloratadin）是一种H1受体拮抗剂，抗过敏作用强，一般用于荨麻疹及过敏性鼻炎。2023年1月广州医科大学李斌团队在Signal Transduction and Targeted Therapy （IF=39.3）杂志发表题为“Blockade of NMT1 enzymatic activity inhibits N-myristoylation of VILIP3 protein and suppresses liver cancer progression”的论文，他们的研究表明地氯雷他定通过与靶蛋白肉豆蔻酰基转移酶1(NMT1)结合，抑制NMT1的酶活性，导致下游NF-κB通路被抑制，从而发挥抗肝癌作用。

研究者首先基于由FDA批准的419种药物组成的药库，检测其对肝癌细胞增值的抑制作用，再从中选出文献报道较少且抗肝癌细胞增殖作用强的地氯雷他定（图1A-C），接着对其抗肝癌作用在细胞水平和动物移植瘤层面上进行了验证（图1D-E）。发现地氯雷他定在体内外均能抑制肝癌的增殖。

图1 地氯雷他定在体内外对肝癌细胞增殖和生长的抑制作用

研究者为了探索地氯雷他定发挥抗癌生物活性的分子机制，进行了DARTS实验和质谱分析(图2A)，在候选蛋白中，选择了5种感兴趣的蛋白修饰酶进行进一步研究。分别敲低这五种蛋白，发现只有敲除NMT1降低了肝癌细胞对地氯雷他定的敏感性(图2B)。此外，他们发现NMT1高表达的肝癌患者的生存期显著缩短(图2C)，敲低NMT1抑制了肝癌细胞的增殖(图2D)，过表达NMT1促进了肝细胞癌移植瘤的增长（图2E）。

图2 地氯雷他定直接结合NMT1

SPR实验验证了地氯雷他定与NMT1的结合（图3A），接着为了进一步确定地氯雷他定在NMT1中的结合部位，研究者使用分子对接找到地氯雷他定与NMT1蛋白的4个可能结合位点（图3B）。研究者分检测敲除NMT1后再分别表达四个位点突变的NMT1蛋白对肝癌细胞增殖的影响，发现只有ASN-246位点突变后，细胞活力得到恢复。接着研究者纯化了ASN-246位点突变的NMT1蛋白(图3D)。SPR分析证实了ASN-246位点突变的NMT1蛋白与地氯雷他定的结合亲和力低于野生型NMT1蛋白 (图3E)。上述结果表明地氯雷他定通过靶向NMT1蛋白的ASN-246位点抑制肝癌的进展。

图3 地氯雷他定通过靶向NMT1蛋白的ASN-246位点抑制肝癌的进展

酶活检测发现地氯雷他定能显著抑制NMT1的肉豆蔻酰化酶活性（图4A）。研究者使用代谢标记实验鉴定了地氯雷他定显著下调的被NMT1介导的肉豆蔻酰化蛋白底物 (图4B)。罗丹明荧光和考马斯亮蓝染色证实，地氯雷他定显著降低了肝癌细胞内蛋白质的肉豆蔻酰化水平(图4C)。质谱分析鉴定出291种蛋白质在炔基肉豆蔻酸(ALK-12)组中存在，但在对照组或地氯雷他定处理组中不存在(图4D)。由于NMT1蛋白对N末端氨基酸序列为GxxxS的蛋白质显示出较强的识别能力，作者根据这些标准选择了三种蛋白质VILIP3、PPM1G和FAM129A (图4E)。WB结果显示地氯雷他定对VILIP3蛋白N-肉豆蔻酰化水平具有显著抑制作用(图4F)。接下来，作者构建了N端甘氨酸突变为丙氨酸的VILIP3mut质粒，并在VILIP3基因敲除细胞中重新表达。VILIP3基因敲除显著降低了肝癌细胞对地氯雷他定的敏感性，这种作用可通过过表达VILIP3wt而不是VILIP3mut来取消(图4G)。

图4 地氯雷他定抑制NMT1介导VILIP3蛋白的肉豆蔻酰化

研究者发现地氯雷他定对VILP3的mRNA表达无明显影响（图5A），但能显著抑制其蛋白表达（图5B），CHX实验表明地氯雷他定显著促进了VILIP3蛋白的降解（图5C）。随后研究者使用RNA-seq实验找到下游NF-κB信号通路（图5D）。地氯雷他定对NF-κB途径的抑制作用能通过敲除VILP3来逆转，且只有过表达野生型的VILP3能部分恢复其抑制作用。

图5 地氯雷他定促进VILIP3蛋白降解抑制NF-κB信号通路

本研究首先在细胞水平从FDA批准的药库中筛到抗肝癌药物地氯雷他定，接着使用DARTS技术加质谱分析找到靶点NMT1，然后炔基肉豆蔻酸加点击化学的方法找到下游VILIP3，接着通过RNA-seq的方法找到下游通路，后续做了rescue实验进行验证。在机制上，地氯雷他定与NMT1的ASN246位点结合并抑制其酶活性，破坏NMT1介导的VILIP3蛋白的肉豆蔻基化和随后的NF-κB/Bcl2信号转导，从而抑制肝癌的发生发展。

图6 地氯雷他定抑制NMT1酶活性和肿瘤形成的示意图