多中心队列（n=292）：HCs（n=56）、CH（n=50）、LC（n=54）、HCC（n=132）

1、SF3B4在HCC中过表达且与HCC预后有关

使用泛癌症数据库TCGA检测SF3B4在肿瘤和非肿瘤组织中的表达，发现SF3B4在10种癌症的肿瘤组织中较非肿瘤组织中显著上调。进一步通过生存分析研究了HCC患者预后与SF3B4表达之间的关系，发现SF3B4高表达患者的总生存期（OS）、无病生存期（DFS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展生存期（PFS）较差。Cox回归分析显示，SF3B4高表达是HCC患者OS和DFS的不良预后因素。Human Protein Atlas数据库和患者组织免疫组化分析结果一致提示：与非肿瘤组织相比，SF3B4在肿瘤组织中高表达。

首先使用v3.0 版本20 K蛋白芯片进行SF3B4自身抗体检测（华盈生物可提供v4.0版本蛋白芯片检测服务），分析来自健康对照（n=5）、LC患者（n=5）和早期HCC患者（n=15，5个患者在诊断前1年、诊断前6个月和诊断时分别收样）的25份血浆样本，研究SF3B4自身抗体作为HCC血液生物标志物的诊断潜力。聚类分析显示，SF3B4自身抗体在LC患者和HCC患者中呈阳性结果，而在对照组中未检测到。ROC曲线分析表明SF3B4自身抗体作为生物标志物有良好的特异性和敏感性。

进一步，在队列1（n=248）和队列2（n=180）中通过ELISA检测SF3B4蛋白和SF3B4自身抗体表达水平。虽然HCC患者血浆SF3B4蛋白/自身抗体水平高于HCs，但是CH、LC和HCC之间无显著差异，且ROC曲线分析进一步显示，血浆SF3B4蛋白/自身抗体的诊断效能低于或与传统标志物AFP相似。

先使用ExoCarta和exoRBase 2.0数据库确认SF3B4在人血源性EVs中的表达，随后进行PCR验证分析，结果显示SF3B4在HCC细胞系及细胞上清EVs中的表达高于正常肝细胞组。此外，在10例HCs和10例HCC的血清和血清EVs中均检测到SF3B4表达，且SF3B4在HCC血清EVs中的表达显著升高。

进一步，在队列3（n=159）和外部队列（n=142）样本中检测血清EV-SF3B4的表达水平，验证其作为HCC液体活检标志物的诊断性能，结果显示血清EV-SF3B4的表达随着肿瘤进展而逐渐上升。研究人员首先在队列3中比较血清EV-SF3B4与AFP的诊断性能，发现在CH/LC以及HCC样本中血清EV-SF3B4的诊断性能均优于AFP。然后在外部队列中对EV-SF3B4和AFP的诊断性能进行严格的验证，获得与之前实验一致的结果，血清EV-SF3B4的诊断性能优于传统标志物AFP。

图3 血清EVs中SF3B4诊断效能评估

4、血清EV-SF3B4和血清AFP联合诊断效果评估

在多中心队列（n=292，排除AFP值缺失的患者后合并队列1和外部队列）对血清EV-SF3B4和血清进行联合分析，结果表明EV-SF3B4与AFP联合检测有良好的特异性和敏感性。此外，研究人员还检测了各组中EV-SF3B4和AFP的阳性率。

5、肝癌微环境中SF3B4与免疫的关系

最后，研究人员探究了HCC微环境中SF3B4表达与免疫之间的关系。通过分析HCC患者单细胞测序公共数据集（GSE151530），评估SF3B4在不同免疫细胞群中的表达水平差异，发现SF3B4在髓源性抑制细胞（MDSCs）中高表达。单细胞测序分析显示SF3B4表达与MDSCs呈最强正相关，同时SF3B4与MDSC标志物（ITGAM、LOX、S100A9、CD80和CD83）呈显著正相关。随着组织学分级的增加，6个基因特征改变水平高的患者比例也随之增加，且基因改变水平高的患者OS、DFS、DSS和PFS更差。

总体而言，该研究直接从已有的组织学标志物SFEB4入手，通过多种方法评估SF3B4作为HCC液体活检标志物的潜力，如蛋白质、自身抗体和RNA水平。研究结果表明，血清小细胞外囊泡SF3B4在HCC早期诊断能力和HCC高阳性率方面具有最佳性能（RNA水平）。此外，SF3B4在MDSCs中高表达，且与MDSC标志物（ITGAM、LOX、S100A9、CD80、CD83）呈高度正相关，六个指标组合可用于HCC诊断，其变化越高，HCC患者预后越差。该研究从组织标志物SFEB4入手，并在血清小细胞外囊泡中得到反映，进而充当肝癌早期诊断的循环生物标志物，对我们开展其他疾病相关标志物提供了很好的研究范本，研究思路值得借鉴。

Son JA, Weon JH, et al. Circulating small extracellular vesicle-derived splicing factor 3b subunit 4 as a non-invasive diagnostic biomarker of early hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Oct 30;42（1）:288.