外泌体含有诸如膜受体、离子通道、GPI蛋白等多类型的膜蛋白，它们不仅可以作为功能分子指导外泌体靶向特定组织，介导与受体细胞的相互作用，还可以被应用于分离特定的外泌体，例如利用流式或者免疫亲和分离特定膜蛋白表达的外泌体亚型。除此之外，深入研究和开发外泌体膜蛋白具有非常重要的临床转化价值。

案例一:基于外泌体膜蛋白的载药研究 

Codiak公司今年在Molecular Therapy（IF: 11.454）1上发表了他们其中一个外泌体载药平台的研发流程。该平台利用可高效负载在外泌体膜上的蛋白PTGFRN 和BASP1作为结合药物的支架分子。

研究人员利用碘克沙醇密度梯度离心收集HEK293细胞上清的外泌体，然后对收集的包括外泌体在内的4个不同密度组分（F1-F4）进行了蛋白质组学质谱分析，鉴定了外泌体（F1）中高表达的蛋白（图1A）。之后研究人员聚焦于膜蛋白，分析哪些膜蛋白分泌进外泌体中的含量最多。研究人员首先选定了几个丰度高的膜蛋白及经典的外泌体marker如CD63、CD81和CD9，然后构建了它们和GFP的融合蛋白（图4B），在HEK293细胞中过表达，然后对比检测转染细胞上清中外泌体中GFP的荧光信号，结果显示了PTGFRN融合蛋白的信号强度最高（图1B）。之后研究人员也分析了这几个膜蛋白的定位于外泌体膜上的关键氨基酸序列区段（图1C）。最后研究人员展示了其中两个膜蛋白的载药性能，一个是单次跨膜蛋白PTGFRN和胞质内锚定在膜上的BASP1蛋白。

图1.筛选和验证HEK293细胞来源的外泌体中高度富集的膜蛋白

研究人员利用PTGFRN和BASP1为骨架构建了多个融合蛋白，在HEK293细胞中过表达，然后收集外泌体检测这些融合蛋白的活性，例如PTGFRN胞外段融合IL-7、CD40L、αCD3和IL-12（图2A），相比于重组蛋白，外泌体负载的这些细胞因子具有更强的活性，例如相比重组的IL-12蛋白，负载IL-12的外泌体（exoIL-12）体内抑制肿瘤生长的效能更佳（图2A），据Codiak公司官网显示目前exoIL-12正在开展临床I期试验。另外一个外泌体膜蛋白BASP1融合了鸡卵清蛋白（OVA），研究人员检测是否其可以激活体内的免疫应答，结果显示相比单独的鸡卵清蛋白，载有OVA的外泌体在佐剂环二核苷酸（CDN）刺激下，更能显著性的激活局部和系统性的T细胞活性（图2B）。

图2.外泌体膜蛋白具有很高的载药性能

案例二:基于外泌体膜蛋白的siRNA靶向传递研究 

早在2011年，Nature Biotechnology上就发表了一项利用外泌体膜蛋白lamp2b构建靶向小鼠脑组织的外泌体siRNA载体2。研究人员分离小鼠骨髓来源的树突状细胞，体外培养收集上清外泌体。为了构建靶向脑组织的外泌体，研究人员将特异结合中枢神经系统nAChR的狂犬病毒糖蛋白（RVG）多肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)作为靶向肽段（TP），融合到lamp2b信号肽（SP）后段，之后将编码融合蛋白的载体过表达到树突状细胞，收集转染细胞分泌的外泌体（RVG-exosomes），然后体外将siRNA电转至外泌体中（图3A）。研究人员体内注射了载有siGAPDH 的RVG-exosomes，结果显示了只有在大脑组织中GAPDH的表达才显著下降（图3B），说明了RVG-exosomes靶向脑组织的特异性。

图3. 构建靶向脑组织的外泌体

近期Nature Metabolism杂志上发表了一项基于RVG-exosomes进行载药用来减轻体重的研究3。已有研究表明了在腹内侧核（VMH）神经细胞中失活AMPKα1可以激活交感神经（SNS）活性，进而刺激棕色脂肪组织（BAT）的产热作用，增加能量消耗，导致体重减轻。基于此，研究人员构建了显性失活型载体AMPKα1-DN，并上游插入类固醇生成因子1（SF1）启动子，皆在指定于VMH 的SF1+神经细胞中表达AMPKα1-DN。研究人员在树突状细胞中过表达lamp2b-RVG载体和SF1-AMPKα1-DN载体，收集转染细胞分泌的外泌体进行动物实验。和之前结果相似，载有lamp2b-RVG的外泌体显著靶向到脑组织（图4A）。PCR检测SF1-AMPKα1-DN序列，结果发现了只有在VMH神经细胞中SF1-AMPKα1-DN才表达（图4B），并且可以显著减弱AMPK下游ACCα蛋白的磷酸化水平（图4C），说明了外泌体靶向VMH的特异性，同时证明了负载的SF1-AMPKα1-DN可以特异的在SF1+神经细胞中发挥抑制作用。最后研究人员也评估了外泌体在体内的作用时效大约在24小时内（图4D）。

图4.负载SF1-AMPKα1-DN的外泌体体内靶向性分析

研究人员之后在DIO肥胖小鼠模型中，尾静脉注射SF1-AMPKα1-DN外泌体，可以呈现短期（6d）和长期（21d）减轻小鼠体重的效果（图 5A,B）。最后研究人员也证明了注射SF1-AMPKα1-DN外泌体肥胖鼠的BAT产热增加（图5C），同时上调产热相关的蛋白表达，例如UCP1、UCP3、PGC1（图5D），在UCP1缺失的小鼠中，SF1-AMPKα1-DN外泌体的作用消失，说明外泌体通过调控UCP1等产热基因的表达从而促进BAT的能量消耗（图5E）。最后研究人员也证实SF1-AMPKα1-DN外泌体也可以激活交感神经的活性（图5F）， 并且交感神经活性的抑制剂SR59230A可以显著减弱SF1-AMPKα1-DN外泌体的作用效果（图5G）。

图5.负载SF1-AMPKα1-DN的靶向脑组织外泌体可以减轻体重

|  华盈生物-外泌体“一站式”服务平台

华盈生物作为外泌体服务领域的专家，拥有独特的系统性服务优势，可实现外泌体研究的“一站式服务”。华盈生物的外泌体服务产品也基本扩展到了外泌体研究的方方面面。在外泌体蛋白质组学方面，华盈生物不仅可以提供高品质的质谱技术服务，更是将外泌体膜蛋白检测的明星技术：纳米流式、超灵敏simoa技术、定制化抗体芯片服务整合入外泌体膜蛋白服务体系中，为外泌体膜蛋白标志物开发、外泌体膜蛋白靶向载药研究等提供技术支撑。

|  参考文献

1.Dooley K, McConnell RE, Xu K, Lewis ND, Haupt S, Youniss MR et al. A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties. Mol Ther. 2021;29(5):1729-1743.

2.Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. Delivery of sirNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011;29(4):341-345.

3.Milbank E, Dragano NRV, González-García I, Garcia MR, Rivas-Limeres V, Perdomo L et al. Small extracellular vesicle-mediated targeting of hypothalamic AMPKα1 corrects obesity through BAT activation. Nat Metab. 2021;3(10):1415-1431.