研究首先采用多种策略（CMAP、DARTS和TPP）来识别与AIN直接相互作用的蛋白质靶标（图1A）。首先研究基于之前建立的MCF-7细胞响应102种中药成分（包括AIN）的基因表达谱，选择响应于AIN的225个基因（FC≥2，128个上调和97个下调）提交到CMAP数据库进行分析，结果显示与AIN最正相关的是NF-κB和PRDX1的抑制剂withaferin A，因此CMAP分析结果预测NF-κB和PRDX1是潜在的抗肿瘤靶点（图1B）。然后研究利用DARTS和TPP联合LC-MS/MS分析进一步探索AIN的结合蛋白。DARTS发现了257种潜在的靶蛋白（unique peptides ≥ 2， intensity ratio ≥ 1.5），TPP分析了31种潜在的靶蛋白，取交集后共有4种潜在靶蛋白，包括 PRDX1、PRDX2、PRDX4和NIP7（图1C）。因此结合CMAP结果推测AIN的抗肿瘤靶点涉及其与PRDX的直接结合，包括PRDX1、PRDX2 和PRDX4，并抑制它们的活性。

图1 PRDX1/2 是AIN的潜在靶标

随后，研究采用CETSA分析发现，AIN通过影响热稳定性与PRDX1和PRDX2直接互作（图2A）。接下来通过外源重组PRDX1和PRDX2蛋白进行MST测定，结果显示AIN与PRDX1 和PRDX2蛋白形成很强的结合，Kd 值分别为1.66和9.35μM（图2B）。分子对接和点突变实验发现PRDX1半胱氨酸（Cys52、Cys71和Cys83）和PRDX2半胱氨酸（Cys51、Cys70和Cys172）位点与AIN的羰基形成稳定的氢键（图2D）。酶活实验发现AIN和PRDX1/2的结合抑制了PRDX1/2的活性，且AIN对PRDX1的抑制作用优于PRDX2（图2E）。

图2 AIN通过直接结合PRDX1/2 抑制PRDX1/2活性

细胞实验显示PRDX1和PRDX2显著抑制HCT116结直肠癌细胞增殖（图3A）。AIN可通过抑制PRDX1/2活性抑制结直肠癌细胞增殖并促进细胞凋亡（图3B）。进一步研究证实AIN可以抑制PRDX1和PRDX2 的活性，诱导细胞内ROS产生（图3C）。ROS水平升高可通过一系列下游途径诱导细胞凋亡，其中最重要的是线粒体功能障碍，研究发现AIN通过改变线粒体膜电位的通透性促进细胞凋亡，导致线粒体功能障碍并抑制线粒体呼吸和ATP产生（图3D）。动物实验和类器官检测发现AIN抑制结直肠肿瘤的生长（图3E）。

图3 AIN通过直接抑制PRDX1/2活性来抗结直肠癌

| 研究作用机制模式图如下：

靶标发现是小分子药物研发的主要瓶颈之一，该研究为小分子药物靶标的发现和鉴定提供了一种研究策略。研究基于CMAP分析预测AIN可能的抗肿瘤靶点，联合应用了两种非标记化学蛋白质组学技术：药物亲和力靶点稳定性（DARTS）和热蛋白质组分析（TPP），并结合计算机辅助模拟对接技术以及相关结合实验和功能实验，确定了天然产物AIN通过与PRDX1/2蛋白结合，抑制其清除活性氧的功能，抑制结直肠癌细胞生长。

中药中的活性成分数量众多，针对性的选择一些中药或者中药复方里的主要活性成分，利用扩充中药小分子基因表达谱数据库，同时再结合多种蛋白质组学技术以及生物信息手段，确定中药小分子的靶点及相关通路，是有前途的一种研究策略。

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