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南方医科大学最新研究成果揭示“老药新用”新策略

南方医科大学最新研究成果揭示“老药新用”新策略

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:华盈生物公众号

【概要描述】P7C3作为一种具有神经保护活性的化合物,对神经退行性疾病和神经损伤修复具有良好的疗效。

南方医科大学最新研究成果揭示“老药新用”新策略

【概要描述】P7C3作为一种具有神经保护活性的化合物,对神经退行性疾病和神经损伤修复具有良好的疗效。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:华盈生物公众号
  • 发布时间:2021-12-28 16:02
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P7C3(分子式:C21H18Br2N2O;CAS号:301353-96-8)作为一种具有神经保护活性的化合物,对神经退行性疾病和神经损伤修复具有良好的疗效。P7C3直接作用靶点的鉴定是揭开其作用机理的最关键一环,但目前与P7C3直接结合并受其调节的蛋白质仍知之甚少,且尚无关于P7C3具有抗癌作用的报道。

2021年6月,南方医科大学徐如祥教授团队与华盈生物合作,应用高通量的人类蛋白组芯片技术找到了577个特异性的P7C3结合蛋白,这些蛋白很大一部分都参与了糖酵解通路。同时,该研究首次发现P7C3可通过靶向糖酵解途径中的磷酸甘油酸激酶1(PGK1),在体外和体内实验中抑制胶质瘤的恶性生长。该研究成果于近期发表于国际前沿学术期刊Frontiers in Oncology(PMID:34221965)。

|   P7C3靶标蛋白筛选

为了鉴定P7C3的结合蛋白,研究人员与华盈生物合作采用Huprot 20K人类蛋白组芯片(覆盖2万种人类全长蛋白),该芯片是通过将P7C3生物素化(图1A),与芯片一起孵育,并添加Cy5-链霉亲和素(Cy5-SA)鉴定P7C3的结合蛋白。通过设置实验组(P7C3-Biotin)对照组(Biotin),研究人员确定了577种与P7C3直接相互作用的蛋白。图1B是随机选择的实验组和对照组芯片上的相同区域,显示实验组有更多的阳性信号。图1C展示了鉴定到的蛋白的数量情况,其中,黄色圆圈内的点是只能被P7C3-Bio直接结合的蛋白质;橙色圈内的点是可以直接被P7C3-Bio和生物素结合在一起的蛋白质,而红圈内的那个点就是只能被生物素直接结合的蛋白质。

图1.P7C3靶标蛋白筛选

|   P7C3靶向糖酵解通路

为了深入了解P7C3结合蛋白的功能作用,研究人员使用DAVID数据库对这577个结合蛋白进行GO分析和KEGG pathway分析,结果均显示糖酵解相关蛋白的显著富集。随后,作者构建了P7C3结合蛋白的相互作用网络(图2A),其中评分最高的最紧密连接的簇(Cluster 3)由参与糖酵解途径或与糖酵解途径高度相关的许多酶组成(图2B),这些蛋白与P7C3结合情况在芯片上的展示如图2C。

 

图2.P7C3靶向糖酵解通路

|   P7C3调控胶质瘤细胞中糖酵解过程

随后,作者通过体外培养胶质瘤细胞,对KEGG和GO分析结果(即P7C3结合蛋白与糖酵解密切相关)进行了验证。结果显示P7C3降低了胶质瘤细胞中的葡萄糖摄取以及丙酮酸水平、乳酸水平和ATP的细胞内水平(图3A)。此外,P7C3还能够显著下调细胞外酸化率(ECAR,extracellular acidification rate),增加细胞耗氧率(OCR,oxygen consumption rate)(图3B)。

图3.P7C3调控胶质瘤细胞中糖酵解过程

|   P7C3下调胶质瘤细胞中PGK1的蛋白质水平和激酶活性

在577个候选P7C3结合蛋白中,GCK、HK1、HK2、PGK1、PGK2和ALDOA,直接参与糖酵解过程的调节,成为重点关注的对象。研究人员通过Western Blot检测P7C3对上述蛋白质表达的影响,发现P7C3显著降低胶质瘤细胞中PGK1和PGK2,尤其是PGK1的蛋白表达水平(图4A),同时,P7C3能够显著下调PGK1激酶活性(图4B)。

 

图4.P7C3下调胶质瘤细胞中PGK1的蛋白质水平和激酶活性

|   在线数据库分析PGK1的mRNA水平与临床病理相关性

基于TCGA和CGGA数据库的临床数据,发现PGK1在胶质瘤患者中的mRNA表达水平和临床病理严重程度密切相关,高分化胶质瘤的PGK1 mRNA水平更高(图5A)。此外,PGK1 mRNA高表达的患者与低表达的患者相比,表现出显著较低的总生存期(图5B-C)。

图5.在线数据库分析PGK1的mRNA水平与临床病理相关性

|   PGK1蛋白为P7C3的直接作用靶点

为了解P7C3降低胶质瘤细胞中PGK1的蛋白水平和糖酵解酶活性的机制,研究人员首先使用链霉亲和素亲和试验验证了P7C3和PGK1之间的特异性相互作用,发现P7C3能够直接与PGK1结合(图6A)。为了进一步了解P7C3和PGK1之间的结合模式,研究人员通过基于一级氨基酸序列的MEME基序分析评估了前100个P7C3靶蛋白之间的共有序列,发现了三个共识基序,GGGPALKSCS(E值=1.8e+59)、IYEYKKSLKK(E值=4.1e+82)和EEGEEVVRKI(E值=3.7e+81),然后鉴定了与PGK1结合的P7C3的氨基酸残基(图6B)。

图6.PGK1蛋白为P7C3的直接作用靶点

|   PGK1-P7C3相互作用诱导PGK1降解

接着,研究人员探究了P7C3引起的PGK1蛋白水平降低是否取决于基因转录水平。通过qRT-PCR检测PGK1 mRNA的表达发现,P7C3处理后胶质瘤细胞中PGK1 mRNA没有降低而是增加(图7A),表明由P7C3引起的PGK1蛋白水平降低与PGK1基因转录无关。研究人员进一步进行了PGK1降解分析,发现P7C3处理促进了PGK1的快速蛋白质降解(图7B)。接下来,通过使用MG132(蛋白酶体阻断剂)和CQ(溶酶体抑制剂)阻断泛素介导的蛋白水解途径和自噬-溶酶体蛋白水解途径,发现MG132和CQ处理明显增加PGK1的蛋白水平(图7C),表明P7C3引起的PGK1加速降解依赖于自噬-溶酶体蛋白水解途径。通过透射电子显微镜检测发现P7C3处理处理显著增加自噬体、自噬溶酶体和吞噬体的数量(图7D),且Western Blot显示P7C3处理增加了Beclin-1蛋白水平和LC3-II/LC3-I的比例,表明P7C3-PGK1相互作用诱导了胶质瘤细胞中自噬溶酶体介导的PGK1降解(图7E)。

 

图7.P7C3-PGK1相互作用诱导胶质瘤细胞中自噬-溶酶体介导的PGK1降解

|   P7C3体内和体外抑制胶质瘤进展

最后,研究人员通过体外和体内实验检测了P7C3对胶质瘤恶性进展的影响。关于体外实验,通过CCK8实验发现P7C3处理显著降低细胞活力,通过流式细胞术发现P7C3处理显著增加细胞凋亡,通过EdU染色发现P7C3处理显著抑制细胞增殖,通过划痕实验发现P7C3处理显著抑制细胞迁移,通过Transwell实验发现P7C3处理显著抑制细胞侵袭(图8A-B),表明P7C3在体外可以抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。关于体内实验,研究人员构建了颅内神经胶质瘤异种移植模型,通过活体成像发现P7C3处理的裸鼠平均脑内肿瘤体积更小,Kaplan-Meier分析显示P7C3处理的裸鼠中位存活时间更长,免疫组化结果显示P7C3下调胶质瘤组织中的PGK1蛋白水平,减少脑内肿瘤中Ki67阳性细胞的数量并增加了TUNEL阳性细胞(图8C-D)。表明P7C3在体内抑制神经胶质瘤生长并诱导神经胶质瘤细胞凋亡。

图8.P7C3体内和体外抑制胶质瘤进展

 

|   华盈视角

从药理学的角度来看,阐明药物化合物作用机制的最有效方法是确定其直接结合的蛋白质。在本研究中,利用人类蛋白组芯片技术确定P7C3的直接结合蛋白对于开展后续机制研究十分关键。P7C3具有神经保护作用,但其是否具有抗肿瘤活性,特别是神经系统肿瘤,如胶质瘤,尚未有文献报道。研究人员以此为切入点,发现P7C3通过直接靶向PGK1来调节有氧糖酵解抑制胶质瘤的恶性进展。该研究的技术路线可为广大小分子药物研究工作者提供思路借鉴,即通过蛋白质组芯片技术快速寻找经典小分子药物的直接作用蛋白,阐明药物调控机理。

除了直接作用靶点的筛选及验证,华盈生物针对于中药及小分子药物研究,还建立了一套完整的技术服务体系:

1. 中药/复方的有效成分分离与鉴定;

2. 小分子化合物生物素标记

3.  小分子靶点筛选:芯片+质谱

4. 药物调控信号通路磷酸化筛选

5. 网络药理学与分子对接

6. SPR表面等离子共振(分子动力学)

 

如果广大研究人员手上也有被证实临床药效的小分子单体或中药复方,华盈生物可通过专业的技术服务助您完成一篇高质量的药物靶点-机理研究论文。

|   原文文献

[1]. Chen W, Jia W, Wu C, et al. The Neurogenic Compound P7C3 Regulates the Aerobic Glycolysis by Targeting Phosphoglycerate Kinase 1 in Glioma. Frontiers in Oncology, 2021, 11:644492.

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