铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的新型程序性细胞死亡，它受到细胞抗氧化系统和铁代谢的严格调节。铁死亡与多种疾病有关，如缺血再灌注损伤，急性器官损伤和神经退行性疾病，抑制铁死亡被认为是一种有前途的治疗相关疾病的策略。目前，大多数已知的铁死亡抑制剂属于抗氧化剂或铁螯合剂。然而，非选择性地降低氧化状态而破坏氧化还原平衡可能导致疾病，使用铁螯合剂来清除铁不可避免地会导致副作用，如贫血和许多代谢性疾病。因此，开发既非抗氧化剂又非铁螯合剂的铁死亡抑制剂具有重要的临床意义。

2022年12月，四川大学华西医院杨胜勇团队在Nature Communications（IF=17.694）上发表了题为“Non-classical ferroptosis inhibition by a small molecule targeting PHB2”的研究论文，发现了一种非经典的铁死亡抑制剂，并揭示了一种新的铁死亡调控机制，这些发现可能为铁死亡相关疾病提供一种有前景的干预策略。

为了发现铁死亡抑制剂，研究使用了erastin（广泛使用的铁死亡诱导剂）诱导的ES-2细胞铁死亡模型来筛选包含约4000种化合物的内部化学库（图 1A），发现16种化合物能够保护细胞免受铁死亡，然后通过自由基清除试验和亚铁嗪比色法检测发现只有一种化合物 Cpd-015没有抗氧化和铁螯合活性。在erastin诱导的ES-2细胞铁死亡模型中，Cpd-015的EC50为2.82μM，为了提高Cpd-015的效力，进行了逐步优化过程，制备了7种新化合物，其中化合物YL-939是活性最强的化合物（图 1B），其在erastin诱导的ES-2细胞铁死亡模型中的EC50值为0.09μM。与Cpd-015类似，YL-939既不是抗氧化剂也不是铁螯合剂（图1C 和1D）。

图1 非经典铁死亡抑制剂YL-939的发现

为了验证YL-939的抗铁死亡作用，研究检测了YL-939对另外5种不同细胞系的活性，并采用其他报道的铁死亡诱导剂来诱导铁死亡，结果均显示YL-939 有效地保护细胞免受铁死亡。进一步研究发现，YL-939对硼替佐米诱导的细胞凋亡（apoptosis）、TSZ诱导的细胞坏死（necroptosis）、尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡（pyroptosis）、elesclomol/CuCl2诱导的铜死亡（cuprotosis）均没有挽救，表明YL-939不是细胞凋亡、细胞坏死、细胞焦亡和铜死亡的抑制剂（图2A-2D），而YL-939保护了erastin诱导的线粒体嵴消失和外膜破裂，这是铁死亡的典型表型，表明YL-939是一种有效的铁死亡抑制剂。

图2 非经典铁死亡抑制剂YL-939的验证

随后研究基于ABPP（Activity-Based Protein Profiling）策略确定YL-939的靶点（图3A）。首先研究设计并合成了一种光亲和探针YL-939-1，含有光反应基团二氮丙啶的光交联剂连接的YL-939和一个可点击的炔手柄。该探针在erastin诱导的ES-2和HT1080细胞铁死亡模型中的EC50值分别为0.92μM和1.08μM，表明适用于标记蛋白（图3B）。

图3 ABPP流程示意图及探针活性检测

接下来，将探针与ES-2细胞一起孵育之后，将混合物暴露在紫外光（365nm）下20min，然后与TAMRA-N3缀合。标记的蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后进行凝胶内荧光扫描，结果表明探针YL-939-1以时间和浓度依赖性方式标记33kDa蛋白质（图4A）。随后用探针YL-939-1并孵育细胞，并将混合物暴露在紫外线（365nm）下20min，使用点击化学将YL-939-1结合蛋白与生物素-叠氮化物偶联，并用链霉亲和素珠捕获，然后使用LC-MS/MS进行消化和分析。结果表明大约有400种蛋白质被探针分子标记（图4B）。选择分子量约为33 KDa的蛋白质，依据质谱实验中的强度值（intensity）选择了排名前三的蛋白VDAC1、VDAC2和PHB2进行Pulldown+WB，结果表明只有PHB2蛋白可以被探针拉下（图4C），表明PHB2很可能是YL-939的结合蛋白。

图4 ABPP+MS及pulldown+WB筛选靶点

为了确认YL-939/YL-939-1与PHB2的原位结合，研究采用药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）的无标记小分子靶标识别技术，进行WB发现YL-939/YL-939-1保护PHB2免受链霉蛋白酶的降解，但对PHB2同种型PHB1以及VDAC1和VDAC2没有影响（图5A）。随后的生物成像实验进一步表明，探针产生的荧光信号与PHB2产生的荧光信号很好地重叠（图5B），结果表明YL-939与完整细胞中的PHB2结合。

图5 DARTS +MS及荧光定位验证靶点

随后研究在大肠杆菌表达系统中表达并纯化了PHB2（1-194）蛋白，差示扫描荧光法 （DSF）（图6A）和表面等离子体共振（SPR）（图6B）分析用于测量YL-939和PHB2的结合能力，YL-939结构相似的化合物YL-447在浓度为10μM的铁死亡抑制试验中没有活性，用作阴性对照。YL-939在SPR测定中显示Kd值为3.43 μM，在DSF测定中显示热位移（ΔTm）为2.65°C，而阴性对照在两种测定中均未显示活性。

图6 SPR及DSF验证靶点

接下来研究探讨了YL-939和PHB2之间可能的结合模式。研究采用分子对接预测YL-939的结合位点，由于缺乏PHB2结构信息，AlphaFold预测的PHB2的三维结构被作为受体结构。对接结果表明，YL-939与PHB2形成两个氢键：一个在吡唑环的氮原子和残基D82之间，另一个在哌啶环的氮原子和残基D127之间（图7A）。为了验证预测的结合模式，研究合成了PHB2的两个突变体D82A和D127A，并通过DSF重新测试了YL-939的结合能力。结果表明，这两个突变体几乎消除了YL-939与PHB2的结合（图7B）。此外，与PHB2-WT相比，D82A和D127A突变体降低了铁死亡对erastin的敏感性（图7C、7D）。

图7 分子对接及点突变确定结合模式

最后研究了PHB2在铁死亡调节中的作用，通过siRNA敲低PHB2可显著抑制erastin诱导的铁死亡，在PHB2敲低细胞中恢复PHB2表达后，铁死亡敏感性显著恢复（图8A）。PHB2 敲低或YL-939抑制对GPX4信号通路关键组分（SLC7A11和GPX4）的表达没有影响（图8B），对其他三种途径的核心成分FSP1、GCH1和DHODH的mRNA表达也不影响，表明 PHB2不通过四种已知的信号通路参与铁死亡的调节。此外，与PHB2敲低的效果类似，YL-939处理剂量依赖性地上调铁蛋白mRNA 表达，还以剂量依赖性方式降低了因erastin处理而升高的细胞内铁水平，表明PHB2敲低影响铁死亡中的铁代谢（图8C）。由于铁蛋白吞噬在调节铁蛋白和细胞内铁水平方面起着关键作用，而核受体共激活因子4 (NCOA4) 是引起铁蛋白吞噬的关键分子，研究进一步发现PHB2敲低或YL-939处理以浓度依赖性方式显著增加经erastin处理的细胞中的NCOA4和铁蛋白水平，阻断自噬体/溶酶体，从而抑制铁蛋白自噬（图8D），改善与铁死亡相关的急性肝损伤模型中的肝损伤（图8E）。

图8 PHB2参与铁死亡调节

通过现成的化合物库筛选到具有特定生物学活性的小分子，通过结构优化提高小分子的活性，并通过特定靶点筛选策略确定小分子的直接作用靶点，最后通过细胞或动物实验研究小分子通过靶点发挥作用，该研究的思路是非常值得借鉴的。

1） 研究首先通过约4000种化合物的内部化学库筛选到了一种非经典铁死亡抑制剂Cpd-015，随后通过结构优化过程制备了7种新化合物并筛选到活性最强的化合物YL-939。

2） 接着通过ABPP策略筛选YL-939确定3个可能的靶点，继而通过Pulldown+WB将范围缩小到1个可能靶点，接着通过DARTS、DSF、SPR验证了结合关系，并通过分子对接和定点突变确定了结合模式。

3）最后研究细胞和动物模型验证了YL-939通过靶点PHB2发挥铁死亡调节作用。

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