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JACS | 中山大学尹胜/王军舰通过点击化学发现芫花活性成分治疗前列腺癌新靶点

JACS | 中山大学尹胜/王军舰通过点击化学发现芫花活性成分治疗前列腺癌新靶点

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:达吉特公众号

【概要描述】靶点是中药活性成分在体内发挥作用的基础,用于靶点研究的新思路与新技术亟需被开发。近年来,以点击化学方法为代表的基于活性蛋白质组分析技术为中药活性成分作用靶点的研究提供了新的手段。

JACS | 中山大学尹胜/王军舰通过点击化学发现芫花活性成分治疗前列腺癌新靶点

【概要描述】靶点是中药活性成分在体内发挥作用的基础,用于靶点研究的新思路与新技术亟需被开发。近年来,以点击化学方法为代表的基于活性蛋白质组分析技术为中药活性成分作用靶点的研究提供了新的手段。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:达吉特公众号
  • 发布时间:2022-12-22 15:30
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前列腺癌是最常见的男性泌尿系统恶性肿瘤,去势疗法是治疗早期前列腺癌的标准方式之一,但随着治疗的进程,该疾病终将发展为去势抵抗型前列腺癌(CRPC)。目前临床治疗CRPC的一线药物为恩杂鲁胺和阿比特龙,由于获得性耐药的产生,在治疗后期往往收效甚微。因此,发现能克服耐药的治疗药物具有重要意义。

芫花瑞香宁(Genkwadaphnin),是一种从瑞香科植物芫花(Daphne genkwa)的花蕾中分离出来的瑞香烷二萜。中国药典(2020年版)记载芫花为常用中药,具泻水逐饮、解毒杀虫功效,已有研究报道了其活性成分芫花瑞香宁的各种药理活性,包括抗病毒、免疫增强和抗肿瘤活性等,然而其是否能够治疗CRPC及相关作用靶点和机制尚未确定。

2022年9月,中山大学药学院尹胜/王军舰教授团队合作在J. Am. Chem. Soc.杂志(IF=16.383)上发表题为“Discovery of Highly Potent Daphnane Diterpenoids Uncovers Importin-β1 as a Druggable Vulnerability in Castration-Resistant Prostate Cancer”的文章,从自建的大戟科二萜化合物库中筛选获得一个在体内外具有强效抗CRPC的瑞香烷型二萜小分子DD1芫花瑞香宁发现其直接作用靶点为核转运蛋白Importin-β1,并揭示importin-β1在CRPC进展中的作用及其作为药物靶点的可行性。

 

图片

 

| 01、CRPC药物筛选与疗效确认

 

研究人员通过自建的大戟科二萜天然产物库255个化合物,16类骨架进行CRPC细胞株C4-2B的生长抑制实验,发现瑞香烷型二萜类化合物具有高活性(图1A),其中DD1活性最佳(图1B),进一步实验发现DD1能够显著诱导CRPC细胞凋亡,抑制前列腺癌病人来源肿瘤类器官生长。

 

 

图1 DD1的筛选与疗效确认

| 02、瑞香烷型二萜DD1靶点筛选及验证

 

为了确定DD1的直接靶点,研究人员采用了ABPPActivity-Based Protein Profiling的方法,首先合成了2个生物素标记的光亲和探针DD1-BIO-PT1(PT1)和DD1-BIO-PT2(PT2),分别带有光亲和标签二氮丙啶和苯基叠氮化物(图2),且细胞实验发现他们仍然保留有良好的抗细胞增殖活性。

 

 

图2DD1探针设计及活性验证

随后将PT1、PT2与细胞共孵育,加入或不加DD1用来做竞争,并以D-BIO作为对照。将所得细胞进行光交联结合(365nm紫外线照射)、裂解、Pulldown(链霉亲和素珠富集)和胰蛋白酶消化,最后进行LC-MS/MS检测,采用相对表达FC=2.5为cutoff值,将比较组(见图A的8组比较方式)取交集后,发现核转运蛋白Importin-β1是唯一检测到的蛋白质,表明Importin-β1是DD1的潜在靶点(图3A)。随后利用竞争性结合Pull-down(图3B)、细胞热转移(CETSA)(图3C)、表面等离子共振(SPR)(图3D)等实验进行了证实,并利用片段化蛋白进行pull-down实验(图3E)、光交联质谱分析(图3F)、分子对接(图3G)及残基突变实验表明DD1主要作用于Importin--β1蛋白C端550aa-876aa区域,其中Gln560、Phe577和Leu580是关键的结合氨基酸。

 

图3 瑞香烷型二萜DD1靶点筛选及验证

| 03、DD1通过importin-β1发挥抗CRPC功效

通过分析前列腺癌临床病人TCGA数据库及免疫组化实验分析,发现相比于正常或癌旁组织,Importin-β1在前列腺癌组织中高表达,且与疾病分期、病人Gleason评分和转移程度均正相关(图4A)。Rescue实验发现敲低Importin-β1蛋白的编码基因KPNB1后抑制了细胞增殖,而DD1不能进一步抑制Importin-β1蛋白敲低后的细胞增殖(图4B)。最后研究利用蛋白组学(对细胞核和细胞质单独开展蛋白质组学)(图4C、D)和转录组学(图4E)技术,发现DD1通过抑制Importin-β1影响了多种与CRPC进展密切相关的重要驱动因子(如AR、MYC、E2F1等)的核聚集,进而抑制细胞异种移植瘤病人来源移植瘤PDX模型(图4F)肿瘤生长。

 

图4DD1通过Importin-β1发挥抗CRPC功效

 

综上所述,研究证实了Importin-β1作为抗CRPC新靶点的潜力,并为克服CRPC耐药的药物研发提供了天然先导分子DD1。

 

|   总结与讨论

靶点是中药活性成分在体内发挥作用的基础,靶点确定是中药研发的关键,然而目前关于中药作用靶点的揭示未能获得突破性进展,已成为中药现代化进程中的瓶颈问题,因此,用于靶点研究的新思路与新技术亟需被开发。近年来,以点击化学方法为代表的基于活性蛋白质组分析技术为中药活性成分作用靶点的研究提供了新的手段,而该研究为我们展示了一个清晰的研究思路和策略。

研究思路总结如下:

1)小分子库筛选并确认中药小分子的疗效;

2)利用ABPP技术寻找小分子在靶细胞内的结合蛋白;

3)利用Pull-down、CETSA、SPR等技术进行结合验证;

4)Rescue实验证实DD1小分子通过靶点发挥作用;

5)蛋白组学和转录组学揭示靶点相关下游机制;

达吉特专注于药靶研究,可为您寻找药物靶点提供多种多样的专业的技术服务和解决方案,助您解决药物靶点-机理研究中的各种难题。

 

达吉特针对于中药及小分子药物研究,建立了一套完整的技术服务体系:

1)中药/复方的有效成分及代谢产物分离与鉴定;

2)血清/组织药代动力学分析

3)小分子化合物生物素批量标记

4) 小分子靶点筛选:20K芯片,IP/Pull down+质谱

5)药物调控信号通路筛选:磷酸化抗体芯片,蛋白质组学

6)网络药理学与计算机分子对接

7)SPR表面等离子共振(分子动力学)

8)天然产物化合物库与功能化合物筛选服务

 

|   相关文献

 

[1] Huang JL, Yan XL, Li W, et al.Discovery of Highly Potent Daphnane Diterpenoids Uncovers Importin-β1 as a Druggable Vulnerability in Castration-Resistant Prostate Cancer.J Am Chem Soc. 2022 Sep 28;144(38):17522-17532.

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