四逆散（SNS，Si-Ni-San formula）首见于《伤寒论》，由柴胡、枳实、白芍、炙甘草四味药组成。原治阳郁厥逆证，后世多用作疏肝理脾的基础方，是为心理障碍患者开出的经典中药配方。慢性心理压力是乳腺癌发展的公认风险因素。然而，SNS在慢性心理应激诱导的乳腺癌发展过程中调节雌激素代谢的作用效果，作用机制及生物活性成分尚不清楚。

2022年6月，广州中医药大学第二附属医院王志宇研究员团队发现慢性心理压力通过FXR/HNF4α/EST信号传导导致胆酸和雌二醇升高，促进乳腺癌的生长和转移，而柚皮素是四逆散（SNS）中最具生物活性的化合物，能够靶向EST蛋白促进雌二醇代谢，抑制心理压力诱导的乳腺癌生长和转移。研究成果发表于J Adv Res（IF=12.822）。

研究首先建立了携带乳腺癌的小鼠CUMS（Chronic unpredictable mild stress）模型，经过7天的慢性心理压力刺激后，雌性小鼠注射1 × 10⁶乳腺癌细胞，同时每天一次灌胃SNS悬浮液或生理盐水（图1A）。结果发现，SNS给药显著改善小鼠的抑郁状态（图1B），CUMS显著加快肿瘤生长速度，而SNS抑制CUMS诱导的肿瘤生长和肺转移（图1C）。

图1 SNS抑制CUMS诱导的肿瘤生长和肺转移

研究通过LC-MS分析发现SNS治疗可以显著降低CUMS诱导的肝脏中的雌二醇水平的增加（图2A），且胆酸合成是受CUMS和SNS处理影响的主要途径（图2B）。进一步检测肝脏中EST（雌激素磺基转移酶，调控雌二醇水平）和胆酸受体FXR的表达，发现CUMS明显增强FXR的表达，抑制EST的水平，而SNS治疗起到相反的效果（图2C）。结果表明SNS抑制FXR/HNF4α/EST信号传导导致的胆酸和雌二醇升高。

图2 SNS抑制FXR/HNF4α/EST进而抑制雌二醇升高

为了确定SNS促进雌二醇代谢的有效成分，研究采用HPLC-MS/MS法对配方中的化合物进行分析，共确认173种植物化学物质。通过与体内代谢物交叉，最终确定72种源自SNS的外源性化合物为潜在的活性成分。进一步对前10种丰度较高的化合物进行EST荧光素酶报告基因筛选实验，发现柚皮素、鞣花酸和金丝桃素在触发EST转录方面表现出显著活性，而柚皮素是SNS中最具生物活性的化合物（图3A、3B）。此外，功能分析表明柚皮素可以剂量依赖性地抑制胆酸诱导的FXR表达，诱导EST的升高（图3C）。结果表明柚皮素是负责SNS雌激素调节活性的物质基础。

图3 柚皮素作为SNS的活性化合物

最后，研究建立了斑马鱼乳腺癌异种移植模型，验证了柚皮素在体内的抑制乳腺癌和雌二醇调节作用，确定了柚皮素可以通过FXR/EST通路调节雌二醇代谢，抑制斑马鱼乳腺癌异种移植模型中的乳腺癌生长和转移（图4A）。为了进一步验证柚皮素对CUMS介导的乳腺癌生长和转移的体内抑制作用，研究建立了小鼠乳腺癌异种移植模型，发现柚皮素可以通过FXR/EST途径促进雌二醇代谢，从而抑制CUMS介导的乳腺癌生长和肺转移（图4B）。

图4 柚皮素通过FXR/HNF4α/EST抑制乳腺癌肺转移

中药复方的疗效很多都是明确的，但其活性成分和作用靶点大部分都不是很明确。该案例给我们的中药复方研究提供了一个很好的思路：

1）动物实验确定中药复方的疗效；

2）确定中药复方的作用机制及核心蛋白；

3）明确中药复方的活性成分；

4）动物实验验证该活性成分的疗效及相同机制；

在确定药物活性成分及作用靶点的时候，研究采用的是荧光素酶报告基因筛选实验，发现复方四逆散中特定组分柚皮素能够显著促进关键蛋白EST的表达，从而确定了柚皮素作为四逆散中调节FXR/HNF4α/EST通路的活性化合物。如果采用DARTS，Pull down、SPR进行进一步发现并验证柚皮素直接作用靶点，文章内容将更加丰富。

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