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Clin Transl Med| LncRNA直接结合蛋白的筛选与深入机制挖掘的范例

Clin Transl Med| LncRNA直接结合蛋白的筛选与深入机制挖掘的范例

【概要描述】LncRNA可以通过多种方式发挥作用,既可以结合胞内RNA和miRNA调控mRNA转录和降解,也可以通过直接结合胞内功能蛋白(大于占60%),调节蛋白活性,改变蛋白定位,来影响细胞表型。所以鉴定LncRNA直接结合的靶蛋白,对于深入揭示LncRNA作用机制非常关键。

Clin Transl Med| LncRNA直接结合蛋白的筛选与深入机制挖掘的范例

【概要描述】LncRNA可以通过多种方式发挥作用,既可以结合胞内RNA和miRNA调控mRNA转录和降解,也可以通过直接结合胞内功能蛋白(大于占60%),调节蛋白活性,改变蛋白定位,来影响细胞表型。所以鉴定LncRNA直接结合的靶蛋白,对于深入揭示LncRNA作用机制非常关键。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:
  • 发布时间:2022-08-03 11:36
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LncRNA可以通过多种方式发挥作用,既可以结合胞内RNA和miRNA调控mRNA转录和降解,也可以通过直接结合胞内功能蛋白(大于占60%),调节蛋白活性,改变蛋白定位,来影响细胞表型。所以鉴定LncRNA直接结合的靶蛋白,对于深入揭示LncRNA作用机制非常关键。

2022年1月,浙江大学邵逸夫医院金洪传教授团队在Clin Transl Med(IF=11.492)发表文章,研究利用华盈生物提供的人类蛋白质组芯片技术,发现了胃癌关键lncRNA可以通过直接结合MSI2蛋白,抑制其降解,从而增强c-myc的稳定性,最终促进胃癌(GC)生长的作用机制1

 

|   1.LNC942与GC的化疗耐药和不良预后相关

研究人员使用lncRNA芯片分析化疗敏感细胞(SGC7901和BGC823)和配对的化疗抵抗细胞(SGC-R和BGC-R)的lncRNA表达,发现LNC942在化疗抵抗细胞中上调最为显著(图1A),且得到了qRT-PCR的 验证(图 1B)。接着在化疗抵抗细胞中敲低LNC942表达,并在化疗敏感细胞中过表达LNC942,发现LNC942敲低恢复了SGC-R和BGC-R细胞对DDP的敏感性(图 1C),而LNC942过表达促进了SGC7901和BGC823细胞中的DDP抗性(图 1D)。最后研究人员分析了来自TCGA的RNA-seq数据,发现LNC942的高表达与GC较差的生存期相关(图E、F)。这些数据表明高水平的LNC942在体外促进细胞对DDP的抗性。

 

图1 LNC942与GC的化疗耐药和不良预后相关

|    2.LNC942MSI2直接结合阻止其泛素化稳定 MSI2

细胞定位分析显示LNC942主要位于细胞质中(图 2A),表明可能通过蛋白质-lncRNA相互作用参与调节各种细胞过程。于是研究人员使用荧光标记的LNC942探针通过人类蛋白质组芯片筛选LNC942结合蛋白(华盈生物提供服务)发现LNC942与MSI2特异性结合(图 2B),并通过RIP和RNA pull-down得到验证。同时,IF和RNA FISH实验发现 LNC942与MSI2共定位于细胞质。接着LNC942敲低或过表达仅改变MSI2的蛋白质表达,而不是其mRNA水平(图2C),表明LNC942可能在翻译或通过翻译后修饰调节MSI2的蛋白质水平,进一步研究发现LNC942过表达显著降低泛素化MSI2的水平(图 2D)。

图2 LNC942与MSI2直接结合阻止其泛素化稳定MSI2

β-TrCP的潜在保守DSGXX degron基序存在于各种物种的MSI2蛋白中,研究人员推测β-TrCP可能催化MSI2泛素化,进一步验证发现MSI2与β-Trcp互作(图3A),且LNC942可以阻断MSI2与β-Trcp互作并阻止由β-TrCP过表达引起的MSI2水平下降(图3B),表明LNC942特异性结合MSI2以阻断其与β-Trcp相互作用,从而抑制β-TRCP E3 Ub介导的泛素化和随后的MSI2降解。

 

图3 LNC942与MSI2直接结合阻止其与β-Trcp互作

 

|   3. LNC942 通过 MSI2以m6A依赖性方式稳定c-Myc mRNA促进化疗抵抗

随后研究发现敲低MSI2增加GC对DDP的敏感性,这一过程可通过过表达LNC942来挽救,表明LNC942通过靶向MSI2诱导化疗抵抗(图4A)。已有研究表明,MSI2过表达导致MYC基因表达增加并通过直接结合控制其翻译。研究人员发现LNC942或MSI2的过表达显着提高了c-Myc mRNA和c-Myc蛋白的表达,而敲低结果却相反,表明了LNC942通过MSI2调节c-Myc mRNA的稳定性(图4B)。M6A作为真核生物中最常见的 mRNA 修饰,在调节mRNA的命运中发挥重要作用。研究人员发现化疗抵抗细胞中的c-Myc mRNA比敏感细胞具有更多的m6A修饰,沉默LNC942可上调GC细胞中c-Myc mRNA的m6A水平(图4C)。此外,沉默 METTL3-METTL14-WTAP 复合物损害c-Myc mRNA和MSI2 之间的结合,且抑制LNC942 或 MSI2 过表达引起的c-Myc mRNA的提高(图4D),表明c-Myc mRNA-MSI2 相互作用对 m6A 修饰的依赖性。

图4 LNC942 通过 MSI2以m6A依赖性方式稳定c-Myc mRNA促进化疗抵抗

|   4.LNC942 通过上调 c-Myc 促进化疗耐药

研究人员发现c-Myc在化疗抵抗GC细胞中显著上调,抑制c-Myc会削弱化疗抵抗并增加药物诱导的细胞凋亡(图5A)。值得注意的是,LNC942过表达对化疗抵抗的影响在SGC7901细胞中的c-Myc 沉默后减弱(图5B),表明 LNC942 通过促进c-Myc表达介导GC中的化疗抵抗。c-Myc 对于调节干性也很重要,干性被认为导致化疗耐药性的重要原因。研究人员发现LNC942的敲低会显著抑制SCG-R细胞的成球能力,降低多能转录因子(Sox2、Nanog和Oct4)的表达(图5C)。最后研究人员通过体内实验发现,过表达LNC942的SGC7901细胞的裸鼠对DDP治疗的抵抗力明显高于对照组(图5D),DDP加FK228处理降低MSI2和c-Myc水平及干性标志分子CD44和c-Myc的表达水平。组织芯片显示MSI2水平与GC患者c-Myc水平正相关(图5E),表明抑制LNC942/MSI2/c-Myc可抑制肿瘤生长,增强DDP化疗效果。总之,LNC942可通过上调c-Myc水平,从而诱导GC细胞的干性特征以促进化疗抵抗。

图5 LNC942 通过上调 c-Myc 促进化疗耐药

综上,这些结果揭示了LNC942在GC中的促进化疗抵抗的功能,并且破坏LNC942-MSI2-c-Myc轴可能是发生化疗抵抗的GC患者的一种新的治疗策略。

图6 LNC942抑制MSI2降解增强c-Myc mRNA稳定性促进胃癌化疗抵抗

|   参考文献

[1] Zhu Y, Zhou B, Hu X, et al. LncRNA LINC00942 promotes chemoresistance in gastric cancer by suppressing MSI2 degradation to enhance c-Myc mRNA stability. Clin Transl Med. 2022 Jan;12(1):e703.

 

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