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Sci Transl Med两连发揭示NASH新药定向发现策略

Sci Transl Med两连发揭示NASH新药定向发现策略

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:达吉特公众号

【概要描述】非酒精性脂肪肝炎(NASH)是目前最常见的肝脏疾病,全球患病人数近20亿,且发病率呈快速增长趋势。目前,全球针对脂肪肝炎开展的药物临床试验已有800多项,但目前还没有任何一款药物被FDA批准进入临床。近日武汉大学李红良团队在国际顶级期刊Science Translational Medicine(IF=17.956)发表两篇题为“Multiple omics study identifies an interspecies conserved driver for nonalcoholic steatohepatitis”和“A small molecule targeting ALOX12-ACC1 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and macaques”的封面文章。研究发现了NASH的发病机制及治疗靶点,并针对靶点开发了全新小分子药物IMA-1,为治疗NASH提出切实可行的方向,也为我们的药物的开发提供了重要思路。

Sci Transl Med两连发揭示NASH新药定向发现策略

【概要描述】非酒精性脂肪肝炎(NASH)是目前最常见的肝脏疾病,全球患病人数近20亿,且发病率呈快速增长趋势。目前,全球针对脂肪肝炎开展的药物临床试验已有800多项,但目前还没有任何一款药物被FDA批准进入临床。近日武汉大学李红良团队在国际顶级期刊Science Translational Medicine(IF=17.956)发表两篇题为“Multiple omics study identifies an interspecies conserved driver for nonalcoholic steatohepatitis”和“A small molecule targeting ALOX12-ACC1 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and macaques”的封面文章。研究发现了NASH的发病机制及治疗靶点,并针对靶点开发了全新小分子药物IMA-1,为治疗NASH提出切实可行的方向,也为我们的药物的开发提供了重要思路。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:达吉特公众号
  • 发布时间:2022-07-12 11:39
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非酒精性脂肪肝炎(NASH)是目前最常见的肝脏疾病,全球患病人数近20亿,且发病率呈快速增长趋势。目前,全球针对脂肪肝炎开展的药物临床试验已有800多项,但目前还没有任何一款药物被FDA批准进入临床。近日武汉大学李红良团队在国际顶级期刊Science Translational Medicine(IF=17.956)发表两篇题为“Multiple omics study identifies an interspecies conserved driver for nonalcoholic steatohepatitis”和“A small molecule targeting ALOX12-ACC1 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and macaques”的封面文章。研究发现了NASH的发病机制及治疗靶点,并针对靶点开发了全新小分子药物IMA-1,为治疗NASH提出切实可行的方向,也为我们的药物的开发提供了重要思路。

|   一、发现NASH的发病新机制  :  ALOX12特异性结合ACC1促进NASH进展

研究人员系统绘制了病人、食蟹猴、巴马猪、小鼠NASH模型的肝脏转录组图谱(图1A),发现花生四烯酸代谢通路相关基因,特别是ALOX12在NASH中显著激活,且与NASH的严重程度密切相关(图1B),通过基因敲除和过表达等系列实验证明ALOX12可以显著加剧肝脏脂肪堆积、炎症、纤维化等NASH进程。

 

 

图1.ALOX12在NASH中显著上调促进NASH进展

重要的是研究者通过CO-IP+质谱的手段筛选了ALOX12的互作蛋白(图2A),结合小鼠和巴马猪ALOX12敲除后的蛋白质组学结果,发现8个质谱鉴定到的互作蛋白在上述组学中也有显著差异,说明了与ALOX12密切相关,其中包括ACC1蛋白(图B、C)。随后的CO-IP验证了ALOX12可特异性结合ACC1(图2D),且WB结果也显示敲除或干扰ALOX12可以下调ACC1蛋白表达(图2E)。

 

 

图2.IP+质谱结合蛋白质组学确定ALOX12的互作蛋白ACC1

最后,研究人员,通过CO-IP+质谱的手段筛选了与ALOX12和ACC1共同作用的蛋白,发现这些蛋白主要为调控溶酶体降解途径的相关蛋白(图3A),且发现敲除或干扰ALOX12能调控溶酶体降解途径,改善小鼠和巴马猪的NASH严重程度, 敲除ACC1能够下调NASH相关指标,抑制ALOX12诱导的NASH进程(图3B)。总之,研究揭示了NASH发生发展的核心机制,即ALOX12可直接靶向ACC1促进NASH进展。

 

 

图3.ALOX12结合ACC1调控溶酶体降解途径促进NASH进展

|   二、药物开发 : 特异性阻断ALOX12-ACC1相互作用抑制NASH进展

研究人员基于上述的研究结果,开展了以ALOX12为靶点的NASH药物发现研究之旅。已知的ALOX12抑制剂ML355,可有效改善血栓形成、血小板聚集、胰岛功能障碍,但ML355是否影响ALOX12与ACC1的相互作用,改善NASH进展尚不清楚。首先研究人员通过等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)分析显示了ALOX12和ML355的直接相互作用(图4A),并且与ALOX12敲除的效果一样,ML355处理高脂高胆固醇(HFHC)喂养的小鼠16周后,ACC1在小鼠肝脏中的表达显著下调(图4B),但是小角X射线散射(Small-angle x-ray scattering, SAXS)分析显示了ML355对ALOX12蛋白质构象、ALOX12 与ACC1之间的相互作用并没有显著的影响(图4C、D),并通过CO-IP得到验证(图4E)。这就说明了ML355在体内有效能,但在体外无作用,表明ML355的功能可能是前药的代谢衍生物导致。于是研究人员收集了猕猴血浆静脉注射ML355后不同时间点的样本(图4F),通过Q-TOF质谱仪分析血浆样品,发现ML355的一种主要代谢物是一种葡萄糖醛酸类的物质,将其命名为IMA-1(图4G),通过质谱多反应监测(MRM)技术进行ML355的药代动力学分析表明在猕猴和小鼠血清中的ML355迅速转化为IMA-1,在注射后5min后即可检测到,注射后24小时后循环IMA-1的浓度高于ML355(图4H)。这些结果说明ML355的功能可能依赖于IMA-1。

 

 

图4.ML355的代谢衍生物IMA-1抑制NASH进展

接下来,研究人员使用 ITC检测发现IMA-1直接与ALOX12结合(图 5A)。SAXS和CO-IP 测定结果显示IMA-1可以显著阻止ALOX12和ACC1之间的相互作用(图 5B、 C)。接着研究人员使用分子对接技术在ALOX12中确定了一个IMA-1 结合口袋,位于 ALOX12-ACC1 的结合界面附近,并且预测ALOX12的Gln538残基是IMA-1的核心结合位点(图5E),Gln538残基突变为丙氨酸(Q538A)后ALOX12不再结合IMA-1(图 5D、F)。IMA-1处理HFHC喂养的小鼠16周后,ACC1在小鼠肝脏中的表达显著下调(图 5G)。这些结果表明IMA-1 可直接中断ALOX12-ACC1相互作用。

 

图5.IMA-1可直接中断ALOX12-ACC1相互作用

最后通过系统的药效学评价发现IMA-1可显著抑制小鼠和食蟹猴NASH进展(图6A),抑制脂肪酸合成、趋化因子信号、TNFα信号、TGF-β信号传导和坏死性凋亡等信号通路(图6B),并且IMA-1并不会在小鼠和食蟹猴中引起那些ACC经典酶活抑制剂所导致的高脂血症的副作用(图6C)。在机制研究中,研究人员发ACC1受抑制的程度是决定其是否诱导产生高脂血症的重要原因,传统的ACC抑制剂几乎完全抑制ACC活性,而IMA-1特异性阻断 ALOX12和ACC1互作,促进其溶酶体降解,而不影响其蛋白酶体降解途径(6D)。

 

 

图6.IMA-1特异性阻断 ALOX12和ACC1互作促进其溶酶体降解

|   结论与总结

上述研究是从疾病机制发现到药靶,再到新药发现的一个非常系统的研究案例:第一篇文章通过组学的方法研究NASH的发病机制,找到了关键的功能蛋白ALOX12作为潜在的药物靶点。第二篇文章以已知的靶向ALOX12的小分子药物ML355为突破口,发现ML355体内能够起到改善NASH的作用,但是在体外却不能影响ALOX12蛋白质构象或ALOX12 与ACC1之间的相互作用。于是猜想ML355的功能可能是由体内的代谢衍生物导致的。通过入血成分鉴定和药代动力学分析发现了ML355衍生物葡萄糖醛酸类物质IMA-1是其发挥作用的分子,并发现IMA-1能够阻断ALOX12 与ACC1之间的相互作用进而发挥疗效。

 

文章中的一些关键点需要我们特别注意:

1)如何发现与NASH的发病密切相关的蛋白ALOX12?由于大多数药靶为蛋白质,因此,蛋白质组学成为发现潜在药靶的经典方法。

2)筛选与ALOX12的互作蛋白ACC1:通过CO-IP/Pull down+质谱或人类20K蛋白芯片的手段是必须途径;

3)鉴定ML355的体内代谢衍生物IMA-1:Q-TOF质谱仪筛选+基于MRM技术的药代动力学分析是不可越过的技术手段;

4)验证IMA-1与ALOX12的相互结合位点:分子对接模拟和SPR技术是最常用的技术。

总之,通过对上述技术手段的充分合理的运用,作者实现了药物开发的目标及其作用机制的研究,呈现了两篇高水平文章,为我们提供了非常好的思路借鉴。

 

达吉特针对于中药及小分子药物研究,建立了一套完整的技术服务体系:

 

1)中药/复方的有效成分及代谢产物分离与鉴定

2)血清/组织药代动力学分析

3)小分子化合物生物素批量标记

4)  小分子靶点筛选:20K芯片,CO-IP/Pull down+质谱

5)药物调控信号通路筛选:磷酸化抗体芯片,蛋白质组学

6)网络药理学与计算机分子对接

7)SPR表面等离子共振(分子动力学)

 

如果对药物靶点-机理研究这一块感兴趣并计划开展相关实验的话,达吉特可为您提供专业的技术服务和解决方案,助力您的药物研究之路。

 

|   达吉特-为药寻靶

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