研究人员系统绘制了病人、食蟹猴、巴马猪、小鼠NASH模型的肝脏转录组图谱（图1A），发现花生四烯酸代谢通路相关基因，特别是ALOX12在NASH中显著激活，且与NASH的严重程度密切相关（图1B），通过基因敲除和过表达等系列实验证明ALOX12可以显著加剧肝脏脂肪堆积、炎症、纤维化等NASH进程。

重要的是研究者通过CO-IP+质谱的手段筛选了ALOX12的互作蛋白（图2A），结合小鼠和巴马猪ALOX12敲除后的蛋白质组学结果，发现8个质谱鉴定到的互作蛋白在上述组学中也有显著差异，说明了与ALOX12密切相关，其中包括ACC1蛋白（图B、C)。随后的CO-IP验证了ALOX12可特异性结合ACC1（图2D），且WB结果也显示敲除或干扰ALOX12可以下调ACC1蛋白表达（图2E）。

最后，研究人员，通过CO-IP+质谱的手段筛选了与ALOX12和ACC1共同作用的蛋白，发现这些蛋白主要为调控溶酶体降解途径的相关蛋白（图3A），且发现敲除或干扰ALOX12能调控溶酶体降解途径，改善小鼠和巴马猪的NASH严重程度， 敲除ACC1能够下调NASH相关指标，抑制ALOX12诱导的NASH进程（图3B）。总之，研究揭示了NASH发生发展的核心机制，即ALOX12可直接靶向ACC1促进NASH进展。

图3.ALOX12结合ACC1调控溶酶体降解途径促进NASH进展

研究人员基于上述的研究结果，开展了以ALOX12为靶点的NASH药物发现研究之旅。已知的ALOX12抑制剂ML355，可有效改善血栓形成、血小板聚集、胰岛功能障碍，但ML355是否影响ALOX12与ACC1的相互作用，改善NASH进展尚不清楚。首先研究人员通过等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）分析显示了ALOX12和ML355的直接相互作用（图4A），并且与ALOX12敲除的效果一样，ML355处理高脂高胆固醇（HFHC）喂养的小鼠16周后，ACC1在小鼠肝脏中的表达显著下调（图4B），但是小角X射线散射（Small-angle x-ray scattering, SAXS）分析显示了ML355对ALOX12蛋白质构象、ALOX12 与ACC1之间的相互作用并没有显著的影响（图4C、D），并通过CO-IP得到验证（图4E）。这就说明了ML355在体内有效能，但在体外无作用，表明ML355的功能可能是前药的代谢衍生物导致。于是研究人员收集了猕猴血浆静脉注射ML355后不同时间点的样本（图4F），通过Q-TOF质谱仪分析血浆样品，发现ML355的一种主要代谢物是一种葡萄糖醛酸类的物质，将其命名为IMA-1（图4G），通过质谱多反应监测（MRM）技术进行ML355的药代动力学分析表明在猕猴和小鼠血清中的ML355迅速转化为IMA-1，在注射后5min后即可检测到，注射后24小时后循环IMA-1的浓度高于ML355（图4H）。这些结果说明ML355的功能可能依赖于IMA-1。

接下来，研究人员使用 ITC检测发现IMA-1可直接与ALOX12结合（图 5A）。SAXS和CO-IP 测定结果显示IMA-1可以显著阻止ALOX12和ACC1之间的相互作用（图 5B、 C）。接着研究人员使用分子对接技术在ALOX12中确定了一个IMA-1 结合口袋，位于 ALOX12-ACC1 的结合界面附近，并且预测ALOX12的Gln538残基是IMA-1的核心结合位点（图5E），Gln538残基突变为丙氨酸（Q538A）后ALOX12不再结合IMA-1（图 5D、F）。IMA-1处理HFHC喂养的小鼠16周后，ACC1在小鼠肝脏中的表达显著下调（图 5G）。这些结果表明IMA-1 可直接中断ALOX12-ACC1相互作用。

图5.IMA-1可直接中断ALOX12-ACC1相互作用

最后通过系统的药效学评价发现IMA-1可显著抑制小鼠和食蟹猴NASH进展（图6A），抑制脂肪酸合成、趋化因子信号、TNFα信号、TGF-β信号传导和坏死性凋亡等信号通路（图6B），并且IMA-1并不会在小鼠和食蟹猴中引起那些ACC经典酶活抑制剂所导致的高脂血症的副作用（图6C）。在机制研究中，研究人员发ACC1受抑制的程度是决定其是否诱导产生高脂血症的重要原因，传统的ACC抑制剂几乎完全抑制ACC活性，而IMA-1特异性阻断 ALOX12和ACC1互作，促进其溶酶体降解，而不影响其蛋白酶体降解途径（6D）。

图6.IMA-1特异性阻断 ALOX12和ACC1互作促进其溶酶体降解

上述研究是从疾病机制发现到药靶，再到新药发现的一个非常系统的研究案例：第一篇文章通过组学的方法研究NASH的发病机制，找到了关键的功能蛋白ALOX12作为潜在的药物靶点。第二篇文章以已知的靶向ALOX12的小分子药物ML355为突破口，发现ML355体内能够起到改善NASH的作用，但是在体外却不能影响ALOX12蛋白质构象或ALOX12 与ACC1之间的相互作用。于是猜想ML355的功能可能是由体内的代谢衍生物导致的。通过入血成分鉴定和药代动力学分析发现了ML355衍生物葡萄糖醛酸类物质IMA-1是其发挥作用的分子，并发现IMA-1能够阻断ALOX12 与ACC1之间的相互作用进而发挥疗效。

文章中的一些关键点需要我们特别注意：

1）如何发现与NASH的发病密切相关的蛋白ALOX12？由于大多数药靶为蛋白质，因此，蛋白质组学成为发现潜在药靶的经典方法。

2）筛选与ALOX12的互作蛋白ACC1：通过CO-IP/Pull down+质谱或人类20K蛋白芯片的手段是必须途径；

3）鉴定ML355的体内代谢衍生物IMA-1：Q-TOF质谱仪筛选+基于MRM技术的药代动力学分析是不可越过的技术手段；

4）验证IMA-1与ALOX12的相互结合位点：分子对接模拟和SPR技术是最常用的技术。

总之，通过对上述技术手段的充分合理的运用，作者实现了药物开发的目标及其作用机制的研究，呈现了两篇高水平文章，为我们提供了非常好的思路借鉴。

达吉特针对于中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分及代谢产物分离与鉴定

2）血清/组织药代动力学分析

3）小分子化合物生物素批量标记

4)  小分子靶点筛选：20K芯片，CO-IP/Pull down+质谱

5）药物调控信号通路筛选：磷酸化抗体芯片，蛋白质组学

6）网络药理学与计算机分子对接

7）SPR表面等离子共振（分子动力学）

如果对药物靶点-机理研究这一块感兴趣并计划开展相关实验的话，达吉特可为您提供专业的技术服务和解决方案，助力您的药物研究之路。

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