甲胎蛋白（AlphaFetoprotein，AFP）是一种广泛用于肝细胞癌（HCC）早期检测的生物标志物。然而，AFP的低敏感性和假阴性较高，需要更有效的HCC早期诊断方法。2020年7月，复旦大学附属中山医院肝癌研究所高强教授和丁光宇教授在Journal of Hematology & Oncology（IF=17.388）上发表研究文章，发现了一个由7种自身抗体组成的Panel可用于HCC的无创早期检测，并为了解针对肝癌发生的免疫反应提供了新的线索。

研究从中国三个中心的前瞻性肝癌队列中收集了肝癌、肝硬化和健康对照的1253份血清样本（肝癌，n=611；肝硬化，n=249；健康对照，n=393），其中发现阶段（n=100），测试阶段（n = 576）和验证阶段（n = 577）。

首先通过20K人类蛋白质组芯片从发现队列筛选候选自身抗体标志物，随后利用定制的100个候选自身抗体的蛋白芯片对测试队列进行机器学习建立肝癌自身抗体标志物模型，最后采用定制的100个候选自身抗体的蛋白芯片检测验证队列评估模型诊断效能。

图1 样本入组及检测流程

发现阶段（n=100，其中肝癌n=50，健康对照n=50），使用包含21154种蛋白质的人类蛋白质组芯片鉴定候选AAb。

候选蛋白的筛选标准：1）P≤0.05；2）Fold Change≥1.2；3）阳性率≥10%，（ HCC阳性反应率定义为大于健康对照组的平均值加2×SD）

根据上述条件筛选到81个AAb，结合肝癌相关参考文献额外纳入19个AAb，共计100个候选标志物分子用于进一步验证。

图2 20K人类蛋白质芯片确定候选AAb

|   03 测试阶段：验证100个AAb表达及机器学习建立肝癌自身抗体标志物模型

测试阶段（n=576，其中肝癌n=282，肝硬化n=130，健康对照n=164），使用定制的100个蛋白的的肝癌自身抗体芯片验证上述蛋白。

候选蛋白的筛选标准：1）P≤0.05；2）Fold Change≥1.2；3）灵敏度≥10%，特异性≥90%

确定了55个潜在的标志物，其中，24种AAb能够将HCC与健康人分开，17个AAb能够将HCC与肝硬化分开。

图3 定制肝癌蛋白芯片验证100个候选AAb标志物

随后将55个蛋白采用10倍交叉验证（10-fold cross validation）最终确定了7个蛋白：CIAPIN1，EGFR，MAS1，SLC44A3，ASAH1，UBL7，ZNF428。

图4 鉴定自身抗体标志物组合

最后通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）模型评估7个蛋白诊断肝癌的表现。使用模型Nh = (4n2 + 3)/(n2 - 8) [Nh，隐藏神经元的数量；n，输入神经元的数量]，在研究中，Nh设置为5，选择了包括7个输入节点、隐藏层中的5个神经元和2个输出节点的全连接前馈神经网络。

图5 开发人工神经网络模型

将测试阶段样本（n=576）随机分成10个大小相等的组。使用90%作为训练集，其余10%作为验证集构建了一个ANN模型。该过程重复10次以获得10个ANN 模型。重复50次后，开发了500个ANN模型。

图5 机器学习建立肝癌自身抗体标志物模型

在测试队列中，7-AAb自身抗体模型（敏感性为68.6%，特异性为92.1，AUC=0.894）可识别肝癌，优于AFP（阈值400ng/mL，敏感性=28.4%，特异性=98.7%，AUC=0.808）。

表1 7-AAb自身抗体模型和AFP对HCC的检测性能

将验证阶段（n=577，其中肝癌n=279，肝硬化n=119，健康对照n=179）样本使用500个ANN模型进行盲测。结果显示，使用来自独立队列的577份血清样本（III期）验证7-AAb自身抗体模型的性能。采用ANN人工神经网络，该模型对肝癌检测的敏感性为73.4%，特异性为90.1%，AUC=0.902，同时检测AFP阴性（AFP−）肝癌的敏感性为80.6%，特异性为90.1%，AUC=0.926。重要的是，该模型检测肝癌的灵敏度为62.2–77.5%，优于AFP的30.7%。

表2 7-AAb自身抗体模型对AFP-肝癌的检测性能

对于早期HCC（BCLC 0/A）检测，该模型优于AFP（阈值400 ng/mL），AUC增加约10%。对于中晚期（BCLC:B, C）肝癌检测，模型与AFP（阈值400 ng/mL）相结合，区分肝硬化与对照组时的敏感性为72.2–88.6%，特异性为89.3–96.6%（AUC 0.887–0.967）。该模型用于区分肝癌患者与健康人的敏感性为79.2–94.3%，特异性为90.1–97.6%（AUC 0.918–0.985），用于区分肝癌患者与肝硬化患者的敏感性为58.3–88.6%，特异性为83.7–98.8%（AUC 0.829–0.943）。总之，7-AAb自身抗体模型可应用于早期肝癌的检测。

表3 7-AAb自身抗体模型检测不同分期肝癌样本的性能

总之，研究使用基于蛋白质阵列的方法进行HCC的血清诊断生物标志物筛选，确定并验证了一个由7个自身抗体组成的临床检测模型，可有效检测HCC，尤其是AFP阴性肝癌和早期肝癌，优于传统标志物AFP。该项目发现和验证的自身抗体标志物模型在肝癌的无创早期检测具有潜在的临床价值，并为了解肝癌发生的免疫反应提供了新的线索。

目前，肿瘤相关自身抗体及其组合对于肿瘤患者病情监测、反映预后和免疫治疗效果方面的意义仍需深入探索，基于20K人类蛋白质组芯片方法的筛选方法有望推动肿瘤相关自身抗体的研究进程。除肿瘤之外，炎症、自身免疫性疾病（如：红斑狼疮、类风关、克隆氏病、多发性硬化）等多种疾病中，同样在体内产生和累积大量的自身抗体。

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