结直肠肝转移（CRLM）患者的5年总生存率（OS）为25.2%，而无转移的患者为75.1%。CRLM的手术切除是一种成熟的治疗方法，可将5年OS延长至40-50%。目前，CRLM的分子风险分层基于组织病理学评估和肿瘤活检最为普遍。细胞外囊泡（EVs）作为非侵入性分析方式可以提供有关疾病的独特信息，可用于监测肿瘤对治疗的反应等。然而循环细胞外囊泡蛋白（EVP）特征是否可用于CRLM患者的术前风险分层和化疗反应预测仍然未知。

2022年4月1日，德国国家肿瘤疾病中心研究人员在Molecular Cancer（IF=27.401）上发表题为 “Comprehensive proteomic profiling of serum extracellular vesicles in patients with colorectal liver metastases identifies a signature for non-invasive risk stratification and early-response evaluation”的文章¹，研究发现EVs蛋白可用于CRLM患者的术前风险分层和化疗反应预测。

|   01 实验设计

发现队列：CRLM患者（n = 56；）或良性肝病患者（n = 7；BD）；验证队列：CRLM患者（n = 154；）或良性肝病患者（n = 42；BD）；

收集CRLM患者和BD患者术前和术后的血清EVs，进行Label free蛋白质组学。

|   02 研究计划

1）CRLM患者中EVP浓度的预后价值

无论是术前或术后，与BD相比，CRLM患者血清的EVP浓度（采用BCA定量检测）显著增加（图1A）。单变量Cox回归分析显示，EVP浓度与CRLM患者术前和术后的OS显著负相关（图 1B）。在独立验证队列中同样发现CRLM患者的EVP浓度水平高于BD患者（图 1C），且与OS显著负相关（p = 0.001；图 1D），表明了CRLM患者中EVP浓度的预后价值。

图1 EVP浓度用于CRLM患者预后

2）CRLM患者中EVP种类的预后价值

通过对术前和术后的CRLM患者和BD患者进行蛋白质组学，发现血清衍生的EV中共检测到563种蛋白质，CRLM患者中的76种蛋白质和BD中的10种蛋白质在手术前后有显著差异，其中74个EVP 在CRLM中表达，而在BD中不表达（图2A）。使用74个EVP作为协变量进行单变量分析，发现30个EVP在术前与OS相关。使用LASSO-Cox方法鉴定了6种可用于预后的蛋白，采用ELISA验证确定6种蛋白（CD14、LBP、CFP、SerpinA4、KNG1、CFD）表达水平与组学结果一致。基于6种蛋白的ELISA数据使用多变量Cox回归构建了4个蛋白组成的EVP Panel（CD14、LBP、CFP、SerpinA4），计算风险评分发现在高风险组中术后死亡人数在1年、2年、3年后均显著增加， Kaplan-Meier分析显示高风险和低风险组的中位生存期存在统计学差异（图2B）。独立验证队列同样发现EVP特征可以区分CRLM患者的复发和死亡风险（图2C、D）。此外，与每个队列的TNM相比，EVP特征在1年和第4年之间显示更高的AUC值（图2E），且观察到MSI-H、无新辅助治疗和TNM IVB-IVC期的风险评分增加。

图2 EVP特征用于CRLM患者预后

3）EV蛋白CXCL7可预测对化疗的早期反应

研究人员比较了在手术前CRLM和BD的蛋白组学结果，发现CXCL7和THBS4在CRLM的EV中显著上调（图3A）。由于CXCL7被报道是转移性CRC中存活率低的预测标志物以及CRC中的诊断血清标志物，研究人员对其进行重点分析，发现CXCL7在肿瘤切除后显著下调，表明高表达CXCL7的EV主要来源于肿瘤组织（图3B）。验证队列同样发现CRLM中CXCL7水平与BD相比显著上调（图3C）。在基线和开始化疗后2周从35名接受化疗的患者收集纵向血清样本，在中位间隔3个月后评估肿瘤反应，发现所有6名部分缓解（PR）的患者在化疗开始后2周就表现出EV的CXCL7水平的早期下降，疾病稳定（SD）的患者表现出EV的CXCL7水平没有显著变化，而大多数患有进行性疾病（PD）的患者在化疗开始两周后表现出EV的CXCL7水平的增加（图3D）。最后，通过检测CXCL7表达预测PR与PD，ROC揭示其AUC为 1.00（95% CI：1.00-1.00），优于CEA（图3E）。

图3 EVP特征用于预测CRLM患者化疗反应

总之，该研究提出了一种CRLM患者术前风险区分策略，以提高术后疾病复发和生存率。使用匹配的接受CRLM切除术的患者的术前和术后血清样本，在独立的队列中开发并验证具有术前预后价值的EVP特征，发现EVP特征和EVP浓度为独立的预后因素。

|   总结与讨论

越来越多的文献报道外泌体蛋白用于疾病标志物研究，特别是2020年的Cell文章报道外泌体蛋白可用多种肿瘤的诊断（PMID: 32795414）尤为经典，为我们的外泌体蛋白质组学的标志物研究指明了方向。

关于外泌体样本选择：

目前文献报道较多的是基于血浆/血清进行外泌体研究。由于血小板在凝血过程中会分泌大量的外泌体到血清中，作为背景因素干扰外泌体的研究结果。因此，在非血小板相关的研究中，一般建议可以选择血浆样本进行实验。而这篇文章采用了血清样本也是值得关注的。

关于外泌体提取方法：

在血浆/血清中含有大量的脂蛋白质，外泌体与这些脂蛋白质在物化性质上具有较大的相似性。常规的外泌体分离方法，如超速离心和沉淀法等都无法有效去除血浆/血清中的脂蛋白，严重干扰了下游质谱实验数据的检出率和可靠性。 文章以“Letter to the Editor”形式发表，并未明确提到采用何种方法提取EV，但在血清衍生的EV中检测到563种蛋白质，蛋白量相对偏少，可能受到了外泌体提取方法的影响。

关于外泌体数据分析：

外泌体标志物研究一般可以采用外泌体的粒子数量和外泌体的内容物种类作为标志物，该研究并没有将粒子数量用于标志物，而是将外泌体蛋白含量用于标志物，发现外泌体蛋白浓度可用于预后。虽然普遍情况是外泌体粒子数量越多，外泌体蛋白浓度越高，但很少有文章直接将外泌体蛋白浓度用于标志物研究，这也给了我们一些新的提示。

华盈生物开发了一套完整的外泌体蛋白质组学研究技术服务体系，包含外泌体制备、外泌体鉴定、蛋白组定性定量分析、数据分析等各个环节。在外泌体制备阶段，根据客户需求，华盈生物既可以提供经典的超速离心分离服务，又可以提供脂蛋白去除效果更优的qEV尺寸排阻法分离服务。在外泌体鉴定阶段，华盈生物不仅可以提供经典的NTA分析，还可以提供准确度更高的TRPS分析。在外泌体蛋白组分析阶段，华盈生物可根据总体实验设计，提供基于标记（TMT）和非标记（label free、DIA）的蛋白质组学方法，并在后期标志物验证阶段提供靶向蛋白组学（MRM、PRM）技术。同时华盈生物还提供后续数据的深度分析包括支持向量机，逻辑回归，随机森林算法等机器学习模型构建，，竭力为广大临床科研人员提供更好的标志物研究策略和方案。

|   相关文献

Kuailu Lin, Franziska Baenke, Xixi Lai et al. Comprehensive proteomic profiling of serum extracellular vesicles in patients with colorectal liver metastases identifies a signature for non-invasive risk stratification and early-response evaluation [J]. Mol Cancer. 2022,21(1):91.