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单细胞多组学技术发现CAR-T治疗急性淋巴白血病关键预后标志物

单细胞多组学技术发现CAR-T治疗急性淋巴白血病关键预后标志物

【概要描述】CART19 细胞疗法对患有 B-ALL患者非常有效,90% 的患者最初对治疗有反应。尽管这么高的反应率,但也有将近 50% 的患者会复发,其中很大一部分是 CD19 阳性的患者。

单细胞多组学技术发现CAR-T治疗急性淋巴白血病关键预后标志物

【概要描述】CART19 细胞疗法对患有 B-ALL患者非常有效,90% 的患者最初对治疗有反应。尽管这么高的反应率,但也有将近 50% 的患者会复发,其中很大一部分是 CD19 阳性的患者。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:华盈生物
  • 来源:
  • 发布时间:2022-06-17 16:54
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CART19 细胞疗法对患有 B-ALL患者非常有效,90% 的患者最初对治疗有反应。尽管这么高的反应率,但也有将近 50% 的患者会复发,其中很大一部分是 CD19 阳性的患者。由于以患者特异性方式制造和管理 CAR T 疗法的过程既昂贵又漫长,因此迫切需要预测性生物标志物来更好地权衡治疗的成本和价值,并且用于制定策略改善 CAR T 产品从而延长患者的有效缓解期。之前的很多研究发现了体内外周血中 CAR T 细胞的早期扩增与良好的治疗结果相关,但它无法预测输注前的反应或复发情况。此外,在长期随访研究中发现患者的持续缓解在很大程度上与CAR-T细胞产品剂量无关,因此输液产品的质量比CAR T 细胞的数量更重要。因此,了解注入前的 CAR T 细胞的特征是否与导致 CD19 阳性复发和治疗失败的关系至关重要。

近期多位CAR-T领域的先驱包括Carl June、Stephen Grupp、J. Joseph Melenhorst等联合Isoplexis单细胞功能蛋白组技术团队在Science Advances》上发表最新研究成果[1],利用单细胞多组学发现了输注前CAR-T细胞的关键指标与急性淋巴细胞白血病病人持久性缓解显著相关。研究的发现阶段首先利用单细胞测序技术分析了来自12个急性淋巴细胞白血病病人输注前的CART19产品。这些病人包括10个应答患者,2个非应答患者(NR)。其中应答患者中有5个是持久性完全缓解(CR),5个在试验期间发生了复发(RL)。因为对基线期未受到刺激的CAR-T细胞进行研究不足以获取反映CAR-T细胞早期扩张的动态信息,因此研究开始前,研究者利用表达特异抗原CD-19的抗原呈递细胞(CD19-3T3细胞)进行刺激CAR-T细胞,同时对比分析其他2个刺激条件包括:TCR介导的刺激(利用anti-CD3/CD28包埋的磁珠进行刺激);表达非特异性抗原间皮素mesothelin的细胞刺激(MSLN-3T3细胞),最后是未刺激的CAR-T细胞(图1)。研究者对这些不同刺激条件下的CAR-T细胞进行了单细胞测序和14个表面蛋白的CITE测序(图1)。

 

图1 研究设计

 

|   01发现与患者响应相关的输注前CAR-T细胞特征性分子信号

单细胞测序结果可以明显将不同刺激条件的CAR-T细胞区分开(图2A)。分析差异基因表达发现刺激的CAR-T细胞高表达很多编码活性细胞因子的基因例如CSF2(编码GM-CSF)、FNG、GZMB等。聚焦分析CAR+细胞也是同样的结果。特别是CD-19或anti-CD3/CD28刺激后,CAR-T细胞高表达CSF2基因,因此CSF2+ CAR-T细胞被定义为一群具有功能活性的CAR-T细胞。研究者首先鉴别与患者持久性响应相关的CD-19刺激的CAR-T细胞特征性细胞因子基因信号。通过细胞因子基因共表达模块分析,发现了几个细胞因子不同的模块(图2B)。其中Type2细胞因子信号(TH2因子)显著表达在CD-19刺激的CAR-T细胞亚群,并且在持久响应组病人中表达TH2因子信号的CAR-T细胞显著高于复发组和非应答组(图2C-E)。说明了CD-19刺激的CAR-T细胞高表达TH2因子与患者持久应答具有显著相关性。

 

图2 单细胞测序分析CAR-T细胞

 

|   02基因表达和功能富集分析验证只有TH2基因、通路与患者预后相关

差异比较持久响应组和复发组CAR-T细胞的基因表达,同样发现了很多TH2基因(IL4、IL5、IL13)在持久响应组显著上调(图3A)。IPA分析发现了持久响应组上调的基因只有和TH2相关通路具有显著相关性。分析组别中每一个患者的CAR-T细胞也表明了TH2基因(IL4、IL5、IL13)及上游调控基因GATA3在持久响应组中显著高于复发组(图3A)。单细胞测序的聚类分析也证明了只有高表达IL4、IL5、IL13基因的cluster细胞在持久响应组中显著多于复发组,而不是表达其他基因的cluster(图3B)。

 

图3 TH2基因、通路在复发组的CAR-T细胞中显著下降

 

|   03单细胞蛋白组验证CAR-T细胞表达的TH2细胞因子与患者预后的关系

了验证发现阶段单细胞测序的上述结果,研究者纳入了另外2个独立的病人群体,包括26个CAR-T细胞治疗后持久响应的患者和23个治疗后复发的患者,通过流式细胞术和Isoplexis单细胞功能蛋白组这2种单细胞蛋白检测技术验证发现阶段的结果(图4A)。首先流式细胞术验证了TH2因子阳性的CAR-T细胞数量在持久响应组中显著高于复发组(图4B)。然后Isoplexis单细胞功能蛋白组分析了32种单个CAR-T细胞分泌的细胞因子,聚焦分析TH2因子IL4、IL5、IL13的多功能性指数(分泌3个因子的细胞比例x 3个因子的信号强度),结果发现了持久响应组CAR-T细胞的TH2因子多功能性指数显著高于复发组(图4C、D)。这些单细胞蛋白组的结果近一步的验证了单细胞测序的结果,从单细胞的功能蛋白层面说明了CAR-T细胞表达的TH2细胞因子高表达与患者持久性应答具有显著相关性。

 

图4 单细胞蛋白组分析CAR-T细胞的功能表型

 

|   04发现和验证不同类型的CAR-T细胞比例与患者应答的相关性

除了上述的分子特征信号,研究者在发现阶段通过CITE测序发现了记忆性CAR-T细胞亚型在在持久响应组中显著高于复发组,而效应性CAR-T细胞的比例却在复发组中显著提高(图5A、B)。在包含2个独立病人人群的验证阶段,通过流式细胞术分析各T细胞亚型marker,同样发现了记忆性CAR-T细胞在在持久响应组中显著高于复发组(图5C)。这些结果从T细胞亚型比例上发现了记忆性和效应性细胞的比例也可以预测患者应答或复发。

 

图5 发现不同CAR-T细胞比例与患者预后的关系

 

|   05构建输注前CAR-T细胞预测患者持久性响应或复发的质量评估指标

最后研究者通过机器学习整合了CD19刺激的CAR-T细胞表达的TH2细胞因子表达强度、TH2细胞因子阳性的CAR-T细胞比例以及记忆性和效应性CAR-T细胞的比例这3个维度的数据,构建了在输注前CAR-T细胞中显著预测患者持久性应答的预测质量指标(图6)。这个预测指标可以精准预测CAR-T细胞疗效,或许可以作为指导大规模CAR-T细胞制备、评估性能的指控指标。

 

图6 构建CAR-T细胞预测患者持久性响应质量评估指标

由于细胞的异质性,单纯从群组水平分析CAR-T细胞的指标不足以精确的发现CAR-T细胞性能与患者预后的关系。所以利用单细胞技术发现CAR-T细胞的质量指标势在必行。单细胞多组学技术可以帮助大家在不同纬度上发现和验证关键的CAR-T细胞质评指标。单细胞测序可以发现关键的细胞亚群及分子信号。而单细胞蛋白组例如CyTOF可以在蛋白水平进行验证,同时也可以鉴定关键的细胞亚群及特征性蛋白marker。最重要的是以Isoplexis为主要技术的单细胞功能蛋白组会进一步的在单细胞功能性层面验证和揭示关键的CAR-T细胞的多功能性与患者预后的相关性。

华盈生物可以提供单细胞多组学不同层面的解决方案,助力各大药企、科研机构精准的评估CAR-T细胞产品的性能,发现与治疗效果显著相关的指标,更有效的指导CAR-T细胞的前期设计和制备,加速CAR-T细胞治疗产品的研发进程。

 

华盈生物单细胞服务体系

 

|   参考文献

1.Bai Z, Woodhouse S, Zhao Z, Arya R, Govek K, Kim D et al. Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with ALL. Sci Adv. 2022;8(23):eabj2820.

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