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Cell Metabolism:外泌体miRNA与胰岛素抵抗

Cell Metabolism:外泌体miRNA与胰岛素抵抗

  • 分类:华盈视角
  • 作者:华盈生物
  • 来源:华盈生物公众号

【概要描述】外泌体miRNA与胰岛素抵抗

Cell Metabolism:外泌体miRNA与胰岛素抵抗

【概要描述】外泌体miRNA与胰岛素抵抗

  • 分类:华盈视角
  • 作者:华盈生物
  • 来源:华盈生物公众号
  • 发布时间:2024-01-31 11:21
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胰岛β细胞通过分泌胰岛素释放到血液中,进而分散到全身各处发挥其独特的生物学作用,胰岛素与敏感组织器官上的细胞膜受体结合,促使一系列信号转导,从而引发蛋白激酶、磷酸酶的级联反应,最终引起下游相关的生物学效应,包括葡萄糖转运,糖原、脂肪及蛋白质的合成。而胰岛素抵抗是由于胰岛素的主要效应器官对胰岛素的敏感性下降,使得胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降。胰岛内部各细胞间存在复杂的信号交流,外周组织脏器所释放的激素、调控因子、代谢产物均参与和胰岛的通讯1。胰腺和其他器官之间的相互作用形成了一个调节网络,该调节网络通过分泌因子来调节葡萄糖稳态。在胰腺与周围器官的通信中发挥着怎样重要作用呢?今天华盈视角根据一篇高分文献的解读为大家揭开外泌体miRNA在其中的作用。

2021年1月7日,美国加利福利亚大学研究人员在Cell metabolism上发表了题为“MiR-690, an exosomal-derived miRNA from M2-polarized macrophages, improves insulin sensitivity in obese mice”的文章2。该研究发现,M2极化的巨噬细胞来源的外泌体(M2-polarized macrophage-derived exosomes,)可改善肥胖相关的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗,而外泌体中的miRNA-690发挥重要作用。该研究作为外泌体研究里面的一个经典案例,具有较强的借鉴意义。其主要研究思路如下:

|   第一步:外泌体分离鉴定

首先,作者通过IL4/IL13干预小鼠骨髓来源的巨噬细胞使其分化为抗炎M2样表型,随后采用超速离心的方法提取外泌体(M2 Exos),并通过电镜、NTA、WB对外泌体进行了鉴定(图1)。

图1 M2 Exos的电镜、粒径和western blot鉴定

|   第二步:外泌体动物实验示踪

通过对M2 Exos进行PKH26标记,然后静脉注射小鼠,免疫荧光实验证明M2 Exos可被外周胰岛素靶向组织(肝脏,骨骼肌和脂肪组织)摄取(图2)。

图2 M2 Exos被肝脏、骨骼肌和脂肪组织摄取

|   第三步:体内和体外实验验证外泌体功能

体内实验发现M2 Exos干预明显改善葡萄糖耐量和胰岛素耐量(图3A-B)。体外实验发现M2 Exos干预的3T3脂肪细胞和L6肌细胞均可在胰岛素刺激后摄取大量葡萄糖(图3C-E)。总之,此部分通过体内体外实验发现M2 Exos可减轻肥胖诱导的胰岛素抵抗。

图3体外体内实验验证M2 Exos减轻肥胖诱导的胰岛素抵抗

|   第四步:通过外泌体组学确定功能分子

作者随后通过small RNA sequencing analysis对Obese ATM-Exos和Lean ATM-Exos建立M2 Exos 的miRNA谱。并在3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运筛选试验中检测了前20个过表达miRNA中的5个,发现在这些miRNA中,miR-690的表达上调更为显著,且后续细胞实验验证了M2 Exos中miR-690的表达。

图3 miRNA测序结合细胞实验筛选差异miR-690

|   第五步:确定外泌体功能分子的生物学功能及下游机制

通过动物实验验证M2 Exos干预4周后关键代谢组织中miR-690丰度明显升高,随后人工合成了Cy3标记的miR-690,通过体内体外实验验证miR-690诱导胰岛素敏感的表型。接着通过对3T3-L1脂肪细胞进行了mRNA测序,发现miR-690的过表达将上调JAK/STAT和胰岛素信号通路,而将下调诸如谷胱甘肽代谢通路,并通过细胞实验进行了验证。最后,通过TargetScan Mouse 7.2预测miR-690的靶基因Nadk,并通过miR-690过表达及荧光素酶报告基因检测验证了两者之间并进行了靶向关系及靶基因功能验证。

图4 RNA-Seq确定miR-690调控靶细胞的信号通路及miR-690与Nadk之间的靶向关系验证

上述案例为大家提供了外泌体miRNA参与疾病发生发展机制的研究思路和技术路线,文章围绕外泌体展开,首先对目标细胞进行外泌体的分离鉴定和示踪,其次利用了测序数据找到功能分子,最后通过敲低/过表达实验进行各项功能和机制验证。

|   华盈视角

该案例在给我们启示的同时,也存在很多可以改进的地方,值得我们深入探讨。

1)外泌体提取纯度问题:

目前,有虽然较多的文章采用超速离心的方法提取外泌体,但是,综合最近的高分文献来看,越来越倾向于密度梯度离心的方法,要由于密度梯度离心提取的外泌体纯度更高,尤其适合于进行后期蛋白质谱、基因测序等深入研究。由文章中的电镜图可以发现,提取到的外泌体仍有较多杂质,这些杂质是否影响下游的miRNA测序和细胞功能研究尚未可知。

解决方案:华盈生物除了提供常规试剂盒方法(EIQ3系列)和超速离心的方法提取外泌体外,更有密度梯度离心的方法用于针对特定的高纯度外泌体的提取。

2) 体内荧光示踪:

目前外泌体的标记方法多种多样,包括PKH26/DiO/量子点、荧光示踪等。文章中体内外泌体示踪实验采用的是静脉注射PKH26-labeled M2 Exos,采用冰冻切片免疫荧光观察外泌体的组织分布。PKH26半衰期相对较短、光漂白和非特异结合等问题普遍存在,在进行体内实验示踪时不是最好的技术选择。

解决方案:华盈生物目前拥有更适合于体内外泌体示踪的方法——量子点标记技术,作为是一种低毒、高灵敏、非侵入性的实时活体成像的方法,其具有优良的近红外(NIR)荧光和磁共振(MR)成像能力,可用于MV在体内实时有效的标记示踪。并且量子点的荧光寿命长,耐光漂白,信号稳定,对微囊泡损伤较小,无毒性。通过控制量子点的标记条件,还可以定向控制每个外泌体上量子点的标记数量,并通过近红外显微镜在长波段(> 600nm)观测,可有效避免了活体成像中动物体内常规短波段自发荧光的噪声干扰。量子点在外泌体体内荧光示踪,尤其是活体成像示踪方面具有排他性的优势。 

为何我们普通的外泌体miRNA研究一般只能发到5-7分杂志,而该文章却能够发表在Cell metabolism上?华盈视角也提出了一些思考。

1)系统性研究,更具说服力。该课题组在2017年在Cell杂志上发表了第一篇外泌体miRNA与胰岛素抵抗的文章(PMID: 28942920),文章发现脂肪组织巨噬细胞分泌的外泌体miR-155会促进骨骼肌细胞、肝细胞和脂肪细胞的胰岛素抵抗形成。这次研究的外泌体miR-690的确定采用的是和Cell文章相同的测序数据,上次选择了M1型巨噬细胞中高表达的miR-155促进胰岛素抵抗,这次选择了M2型巨噬细胞中高表达的miR-690改善胰岛素抵抗,见图3A。

2)文章中在确定外泌体miRNA发挥作用的时候,构建了一种条件性敲除鼠(DicerKO mice),该小鼠的骨髓细胞被特异性敲除能够产生成熟miRNA的Dicer基因,导致M2 BMDMs 产生的外泌体不含有miRNA,通过含有或不含miRNA的外泌体处理受体细胞,比较差异表型来验证外泌体miRNA发挥作用,这是文章的亮点之一。

3)文章功能机制研究方面做得工作较为细致。首先,体内实验证明M2 Exos改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗,体外实验证明M2 Exos增强胰岛素响应。其次,基因敲除鼠证明M2 Exos中的miRNA发挥作用,体内实验证明miR-690改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗,体外实验证明miR-690增强胰岛素响应。接着,体内实验证明外泌体miR-690改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗,体外实验证明外泌体miR-690增强胰岛素响应。最后,找到miR-690的靶基因Nadk,并进行了靶向关系验证及靶基因功能验证,非常系统。

 

华盈生物作为外泌体服务领域的专家,拥有独特的系统性服务优势,可实现外泌体研究的“一站式服务”。华盈生物的外泌体服务产品也基本扩展到了外泌体研究的方方面面,包括:外泌体的三项鉴定(电镜、WB、NTA)、外泌体蛋白组筛选(lable free、DIA、PRM、MRM)、外泌体核酸筛选(miRNA、RNA全转录组)、外泌体纳米流式检测、外泌体电转(药物分子、核酸)、外泌体细胞&动物功能实验(PKH26/DiO/量子点、荧光示踪)等。

丰富全面的外泌体功能研究手段全都在华盈生物的武器库(红色为华盈生物特色服务)中,还不快来pick?

|   参考文献

[1] Ying W , Riopel M , Bandyopadhyay G , et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate InVivo and InVitro Insulin Sensitivity.[J]. Cell, 2017, 171(2):372.

[2] Wei Y , Hong G , Reis F , et al. MiR-690, an exosomal-derived miRNA from M2-polarized macrophages, improves insulin sensitivity in obese mice. [J]. Cell Metabolism. 2021 Jan 7;S1550-4131(20)30717-8.

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