2021年1月7日，美国加利福利亚大学研究人员在Cell metabolism上发表了题为“MiR-690, an exosomal-derived miRNA from M2-polarized macrophages, improves insulin sensitivity in obese mice”的文章²。该研究发现，M2极化的巨噬细胞来源的外泌体（M2-polarized macrophage-derived exosomes,）可改善肥胖相关的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，而外泌体中的miRNA-690发挥重要作用。该研究作为外泌体研究里面的一个经典案例，具有较强的借鉴意义。其主要研究思路如下：

图1 M2 Exos的电镜、粒径和western blot鉴定

通过对M2 Exos进行PKH26标记，然后静脉注射小鼠，免疫荧光实验证明M2 Exos可被外周胰岛素靶向组织（肝脏，骨骼肌和脂肪组织）摄取（图2）。

图2 M2 Exos被肝脏、骨骼肌和脂肪组织摄取

体内实验发现M2 Exos干预明显改善葡萄糖耐量和胰岛素耐量（图3A-B）。体外实验发现M2 Exos干预的3T3脂肪细胞和L6肌细胞均可在胰岛素刺激后摄取大量葡萄糖（图3C-E）。总之，此部分通过体内体外实验发现M2 Exos可减轻肥胖诱导的胰岛素抵抗。

图3体外体内实验验证M2 Exos减轻肥胖诱导的胰岛素抵抗

|   第四步：通过外泌体组学确定功能分子

作者随后通过small RNA sequencing analysis对Obese ATM-Exos和Lean ATM-Exos建立M2 Exos 的miRNA谱。并在3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运筛选试验中检测了前20个过表达miRNA中的5个，发现在这些miRNA中，miR-690的表达上调更为显著，且后续细胞实验验证了M2 Exos中miR-690的表达。

图3 miRNA测序结合细胞实验筛选差异miR-690

|   第五步：确定外泌体功能分子的生物学功能及下游机制

通过动物实验验证M2 Exos干预4周后关键代谢组织中miR-690丰度明显升高，随后人工合成了Cy3标记的miR-690，通过体内体外实验验证miR-690诱导胰岛素敏感的表型。接着通过对3T3-L1脂肪细胞进行了mRNA测序，发现miR-690的过表达将上调JAK/STAT和胰岛素信号通路，而将下调诸如谷胱甘肽代谢通路，并通过细胞实验进行了验证。最后，通过TargetScan Mouse 7.2预测miR-690的靶基因Nadk，并通过miR-690过表达及荧光素酶报告基因检测验证了两者之间并进行了靶向关系及靶基因功能验证。

图4 RNA-Seq确定miR-690调控靶细胞的信号通路及miR-690与Nadk之间的靶向关系验证

上述案例为大家提供了外泌体miRNA参与疾病发生发展机制的研究思路和技术路线，文章围绕外泌体展开，首先对目标细胞进行外泌体的分离鉴定和示踪，其次利用了测序数据找到功能分子，最后通过敲低/过表达实验进行各项功能和机制验证。

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[1] Ying W , Riopel M , Bandyopadhyay G , et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate InVivo and InVitro Insulin Sensitivity.[J]. Cell, 2017, 171(2):372.

[2] Wei Y , Hong G , Reis F , et al. MiR-690, an exosomal-derived miRNA from M2-polarized macrophages, improves insulin sensitivity in obese mice. [J]. Cell Metabolism. 2021 Jan 7;S1550-4131(20)30717-8.