胞外小囊泡（sEVs）可以介导脂肪组织、肝脏、骨骼肌和免疫细胞之间的通讯联系，促进主要效应器官对胰岛素的耐受和敏感性，在肥胖及其代谢并发症的发展中发挥作用¹。华盈视角上一篇公众号文章 “Cell Metabolism：外泌体miRNA与胰岛素抵抗” 介绍了外泌体中的miRNA调控胰岛素抵抗作用机制的研究思路。华盈视角今天分享的新文章主要聚焦在外泌体脂质与胰岛素抵抗的机制研究策略上。

已有研究证明了生物活性脂质在非脂肪组织中的积累，也可以促进胰岛素敏感性的损害，异常高的细胞磷脂酰胆碱（PC）脂质会影响能量代谢，并与胰岛素抵抗有关²。基于前人研究基础，外泌体的脂质与胰岛素抵抗等代谢疾病的发生及演化关系就存在一定的想象空间，值得深入研究。而具体的研究思路，我们可参考2021年Nature Communications杂志上发表的题为“High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance”文章³。该研究发现高脂饮食（HFD）会显著改变肠道上皮外泌体的脂质谱，外泌体磷脂酰胆碱（PC）会与肝细胞中表达的芳烃受体（AhR，aryl hydrocarbon receptor）结合进而抑制胰岛素激活途径及其关键信号通路PI3K/Akt，造成胰岛素抵抗。本研究具体思路如下：

| 第一步：外泌体分离鉴定

首先，作者收集了高脂饮食（HFD）的肥胖小鼠或II型糖尿病患者的粪便样本（将粪便颗粒收集重悬于PBS 中并手动切碎），采用蔗糖密度梯度离心（图1A）的方法提取外泌体，并通过电镜（图1B）、NTA（图1C）、Western Blot（图1D）对外泌体进行了鉴定。随后，作者推测外泌体可能来源于肠道上皮细胞，所以通过Western Blot和免疫荧光检测了分离的外泌体中表达肠道上皮细胞marker A33蛋白（图1D）。

图1 L-Exo和H-Exo的电镜、粒径和Western blot鉴定

（L-Exo：瘦鼠来源的外泌体，H-Exo：肥胖鼠来源的外泌体）

| 第二步：体内实验验证外泌体功能

作者将高脂饮食（HFD）的肥胖小鼠或II型糖尿病患者的粪便样本中分离的外泌体通过灌胃给药瘦鼠后，发现瘦鼠产生了胰岛素抵抗性。主要表现在以下几个方面：

图2 葡萄糖耐受试验(GTT) 和胰岛素抵抗试验(ITT)

2）钳夹试验期间的葡萄糖输注率明显偏低（图3A），血糖水平明显偏高（图3B）。血浆胰岛素水平无显著改变（图3C）。

图3 钳夹试验（The clamp assay）

| 第三步：外泌体摄取实验

图4 Exos被肝脏巨噬细胞摄取

| 第四步：通过外泌体脂质组学确定功能分子

作者随后对L-Exo（低脂饮食小鼠外泌体）和H-Exo（高脂饮食小鼠外泌体）（图5A、B），进行了脂质组学分析，发现了磷脂酰胆碱（PC）在肥胖鼠来源的外泌体中显著升高（图5C）。

对Healthy-Exo（健康人外泌体）和T2D-Exo（II型糖尿病患者的外泌体）（图6A、B）进行了脂质组学分析，发现了磷脂酰胆碱（PC）在糖尿病患者来源的外泌体中显著升高（图6C）。

图6 Healthy-Exo和T2D-Exo脂质组学分析

通过人工构建高PC含量和低PC含量的外泌体（H-Exo^Lipds PC-：将H-Exo中的PC去除; L-Exo^Lipds PC+：将L-Exo中加入PC），注射到小鼠结肠中，发现注射L-Exo^Lipds PC+的小鼠血液中葡萄糖残留量较注射L-Exo^Lipds的小鼠明显偏高，而H-Exo^Lipds PC-的小鼠葡萄糖残留量与H-ExoLipds的小鼠相比显著降低（图7A）,体外实验发现PC^Lipds处理和H-Exo^Lipds发挥和相同的功能，葡萄糖摄取明显降低（图7B），且PC含量较高的外泌体L-Exo^Lipds PC+和H-Exo^Lipds更多的被肝脏巨噬细胞摄取（图7C）。

图7 外泌体PC的功能验证

1. 作者通过细胞因子抗体芯片广泛筛选了与胰岛素抵抗相关的细胞因子，结果发现H-Exo处理的小鼠血浆和巨噬细胞分泌的中TNF-α、IL-6含量显著上升，造成胰岛素抵抗（图8A）。

图8细胞因子芯片、基因芯片研究外泌体PC作用机制

图9 SPR技术、PCR芯片研究外泌体PC作用机制

综上结果表明肠道H-Exo被巨噬细胞和肝细胞吸收，H-Exo的PC和受体细胞表面的AHR结合，激活AHR后可抑制下游胰岛素相关的基因表达和通路激活，从而对胰岛素抵抗产生调控作用。

| 小结与展望

上述案例解析为大家展示了经典的外泌体脂质参与疾病发生发展机制的研究思路和技术路线。文章围绕外泌体展开研究：首先对高脂饮食和正常饮食的小鼠进行外泌体的分离鉴定，发现高脂饮食小鼠或II型糖尿病患者的外泌体可以使瘦鼠产生胰岛素抵抗性。随后，通过外泌体示踪发现其被肝脏富集，并被肝细胞和巨噬细胞摄取。然后，利用脂质组学技术对正常饮食和高脂饮食的小鼠外泌体的脂质谱进行筛选。发现外泌体膜上的磷脂酰胆碱（PC）在高脂饮食小鼠分泌的外泌体中发生了显著改变。最后，通过敲低/过表达实验及各种芯片对外泌体如何调控受体细胞功能，造成胰岛素抵抗的机制综合论证。

针对外泌体脂质相关研究，华盈视角的粉丝也经常会提出一些实际工作中会遇到的高频问题，华盈视角小编也给大家提供一些建议：

Q1．外泌体中有各种蛋白、核酸，我们为什么要进行外泌体脂质研究?

1． 外泌体脂质含量多，类型多，目前有1116种脂质在外泌体中被发现，见Exocarta数据库，包括常见且含量较高的鞘磷脂（SM）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰丝氨酸（PI）、磷脂酸（PA）、神经酰胺（Cer）以及胆固醇⁴。

2. 外泌体脂质发挥重要的生物学功能，可参与免疫监视、肿瘤微环境的修饰或炎症的调节等⁵；

3. 外泌体脂质与外泌体蛋白、miRNA一样在医学上均可以被用作生物标志物⁶。然而，受制于技术手段的限制，对于脂质组的研究相较于核酸和蛋白仍然存在较大空白区。

Q2．针对外泌体脂质研究，采用何种外泌体提取方法更为合适?

外泌体提取常用的方法为超速离心法，对于脂质研究需要获得更高纯度的外泌体，建议采用密度梯度离心的方法，华盈生物可提供完备的密度梯度离心技术服务。

Q3．针对外泌体脂质研究，如何确定目标脂质分子?

在提取外泌体以后，我们可以通过质谱进行脂质组学检测，确定外泌体中脂质的含量及类别。华盈生物能够提供超过500种脂质的绝对定量筛选服务，涉及20多种亚类，包括：鞘磷脂（SM）、磷脂类（PC、PE、PG、PI、PS）、神经酰胺（Cer）和甘油酯（TG、DG），部分检测列表如下：