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高分文章综述:外泌体miRNA在呼吸系统疾病中研究现状

高分文章综述:外泌体miRNA在呼吸系统疾病中研究现状

【概要描述】带你了解外泌体在呼吸系统疾病中的大作为

高分文章综述:外泌体miRNA在呼吸系统疾病中研究现状

【概要描述】带你了解外泌体在呼吸系统疾病中的大作为

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:
  • 发布时间:2022-04-25 12:38
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上一期华盈视角公众号原创文章《文献综述:带你了解外泌体在呼吸系统疾病中的大作为》,为粉丝们追踪了近期发表在高分杂志上关于外泌体携带特定蛋白质调控呼吸系统疾病发生与进展的机制研究。本期华盈视角重点关注4篇高分杂志中发表的将外泌体miRNA作为呼吸系统疾病标志物的研究,分析了相关技术要点,希望帮助华盈视角的粉丝能够快速了解呼吸系统疾病外泌体标志物的研究进展,了解外泌体miRNA的高质量研究策略。

 

| 案例一  痰液外泌体miRNA用于特发性肺纤维化的生物标志物

本研究于2019年发表在Thorax杂志 (IF:9.130)1。研究者入组了6例特发性肺纤维化 (IPF,Idiopathicpulmonary fibrosis)患者和6例健康受试者(HS,healthy subjects),使用超速离心法分离其痰液中的外泌体。随后,通过miRNA芯片分析鉴定到21个差异表达的miRNA(7个miRNA上调、14个miRNA下调)(图1A),并通过入组10例IPF和8例HS的独立样本(cohort 2),结合前面测序的6例IPF和6例HS(cohort 1),共16例IPF和14例HS,采用qPCR对差异最显著的三种miRNA(miR-33a-5p、miR-142-3p、Let-7d-5p)进行了表达水平的验证。

接着,通过ROC曲线对上述几个差异miRNA进行了诊断效能的评估,考虑年龄和性别(Model1:age and sex),发现联合使用3种miRNA时的AUC达0.978(图1B)。并且外泌体miR-142-3p和let-7d-5p 与IPF患者的肺功能指标一氧化碳/肺泡容积 (DLCO/VA)具有显著相关性。这些结果表明了外泌体miRNA可能用于IPF的检测和诊断。

 

 

| 案例二  血浆外泌体miRNA作为吸烟者和慢性阻塞性肺疾病的生物标志物

本研究在2019年发表于J Extracell Vesicles杂志(IF:25.842)2。首先,研究者入组了6例非吸烟者(non-smokers)、6例吸烟者(smokers)、8例慢性阻塞性肺病患者(COPD,Chronicobstructive pulmonary disease),采用ExoQuick或者Exo-Spin试剂盒提取血浆外泌体。通过外泌体small RNA-Seq分别从non-smokers、smokers、COPD中鉴定到139,115,198个miRNA,其中,non-smokers组与smokers相比,有6个显著差异表达miRNA,non-smokers组与COPD相比,有40个显著差异表达miRNA,smokers组与COPD相比,有40个显著差异表达miRNA,这些差异的miRNA能够很好的将各组进行区分(图2A、B)。结果表明,基于外泌体miRNA的分子分析在用于开发COPD 诊断、预后和治疗的生物标志物方面具有巨大的潜力。

 

| 案例三 分枝杆菌感染的外泌体miRNA作为结核病的新型生物标志物

本研究在今年发表于BriefBioinform杂志(IF:11.620)3。研究者对感染结核分枝杆菌H37Ra(Mycobacterium tuberculosis H37Ra)、牛分枝杆菌BCG (Mycobacterium bovis BCG)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia),以及未感染的THP-1诱导的巨噬细胞(THP-1-derived macrophages)培养基采用超速离心法分离其中的外泌体。随后,通过small RNA-Seq总共鉴定到495个的miRNA。通过比较Exo-Ra、Exo-BCG、Exo-Control,设置fold change > 2.0 或 < 0.5,reads > 200,进行差异表达筛选,发现12个在Exo-Ra组和Exo-BCG组均上调的miRNA和2个在Exo-Ra组和Exo-BCG组均下调的miRNA(图3A)。

随后作者选择miR-185-5p(fold change value >5.0且reads >200的miRNA),通过qPCR发现在THP-1诱导的巨噬细胞和PBMCs中单核细胞感染模型中miR-185-5p在感染组外泌体中上调,同时通过临床血浆样本来源的外泌体(入组20例TB患者、17例健康受试者)也验证了这一结果。最后,通过ROC曲线对外泌体miR-185-5p进行了诊断效能的评估,发现AUC达0.978,敏感性50%,特异性93.75%(图3B)。结果表明外泌体miR-185-5p或可用作结核病诊断的生物标志物。

 

 

| 案例四 血浆外泌体miRNA作为哮喘的新型生物标志物

本研究在2020年发表于Allergy杂志(IF:13.143)4。首先,研究人员入组了16例健康受试者(HC,healthy controls)、15例轻中度哮喘患者(AM,mild-to-moderate)、14例重度哮喘患者(AS,severeasthma)。采用尺寸排阻法(Size exclusion chromatography)分离血浆中的外泌体。随后通过small RNA-Seq对血浆中的外泌体进行分析,鉴定到139个的外泌体miRNA(≥10 reads),其中AM 、AS、HC分别为115、114、128个。此外,AS相较于HC,miR-122-5p、miR-191-5p显著上调,同时miR-3168是显著下调的(图4A、B)。

接着,研究人员每组重新入组了10例独立样本,加上前面入组的用于筛选的样本(HC,n=16;AM,n=15;AS,n=16),共计26例HC、25例AM患者、26例AS患者,通过qPCR对血浆外泌体中上面提到的3种miRNA进行验证,发现miR-122-5p显著上调,miR-191-5p无显著改变,miR-3168未能检测到。最后,作者做了一个试验性质的实验(in a pilotapproach),入组了4例HC、10例哮喘患者(AM或AS),qPCR实验发现其痰液外泌体中miR-122-5p和miR-191-5p也发生显著上调。结果表明miR-122-5p在哮喘患者血浆和痰液外泌体中均显著上调,或可用作哮喘的生物标志物。

 

 

| 结论与总结

华盈视角对这4个案例进行了总结,希望能对粉丝们有所启发:

1)针对外泌体的分离,上述文章采用了超速离心法、试剂盒法(ExoQuick、Exo-Spin™)以及尺寸排阻法(SEC)、这些方法在原理上有所不同,提取外泌体质量方面各有特色,华盈提供包括上述方法在内的多种外泌体提取服务,如华盈生物自主研发的EIQ3试剂盒可以实现血清、血浆、尿液、细胞上清等液质样本中外泌体的快速提取,并且测序数据质量与经典的超速离心最为接近,具体对比数据详见文献“Isolation of extracellular vesicle with differentprecipitation-based methods exerts a tremendous impact on the biomarkeranalysis for clinical plasma samples”。

2)关于差异miRNA的筛选,通常我们会采用商用试剂盒或TRIzol进行外泌体RNA的提取,然后采用Small RNA-Seq或miRNA 芯片的方法确定差异表达的miRNA,以上两种技术策略华盈生物均可以提供。

3)最后关于差异miRNA的验证,虽然文章中应用的是普通qPCR,但是在实际研究中,我们并没有足够的样本进行多个miRNA的验证,一般情况1mL血浆分离的外泌体RNA利用普通qPCR方法仅够3-5个miRNA的验证。而华盈生物提供数字PCR(ddPCR),其反应体系和灵敏度是qPCR的10倍以上,因此,ddPCR特别适用于外泌体miRNA尤其是低丰度RNA表达的验证分析。

4)上述文章能在高分杂志上发表的可能原因:案例1主要特点在于,首先采用痰液的外泌体来检测特发性肺纤维化,痰液样本类型独特。案例2在于其入组患者类型,无人报道过非吸烟者、吸烟者、COPD之间的外泌体差异。案例3在于其细致的生物信息数据挖掘,及临床样本验证,案例4在于其思路完整,样本量相对较多。总之,选择样本类型时,我们可以尝试除血浆外的其他体液,在入组患者时,我们尽量区分不同亚型,在高通量筛选标志物后,我们尽可能进行大样本的验证工作,这些手段都将对提升文章档次有一定的帮助。

华盈生物深耕外泌体领域10余年,可为您提供完备的技术检测服务,包括丰富多样的外泌体的提取及鉴定方法、外泌体体内/外示踪、外泌体功能分子筛选及验证、外泌体机制研究常用的组学或芯片技术服务等(红色为华盈生物特色服务),欢迎电话垂询:400-869-2936。

 

| 相关文献

[1] Njock M S, Guiot J, Henket M A, et al. Sputum exosomes: Promising biomarkers for idiopathic pulmonary fibrosis. [J].Thorax, 2018, 74.

[2] Sundar I K, Li D, Rahman I. Small RNA-sequence analysis of plasma-derived extracellular vesicle miRNAsin smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease ascirculating biomarkers.[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2019, 8(1):1684816-.

[3] Chandra K A, Wu Q, Lin L, et al. Exosomal ncRNAs profiling of mycobacterial infection identifiedmiRNA-185-5p as a novel biomarker for tuberculosis. [J].Briefings in Bioinformatics, 2021.

[4] Thomas Bahmer, Susanne Krauss-Etschmann, et al. RNA‐seq–based profiling of extracellular vesicles in plasma reveals apotential role of miR‐122‐5p in asthma[J]. Allergy,2020,76(12).

[5] Peng C, J Wang, Bao Q et al. Isolation of extracellular vesicle with different precipitation-basedmethods exerts a tremendous impact on the biomarker analysis for clinicalplasma samples. [J]Cancer biomarkers: section A ofDisease markers. 2020;29(3):373-385.

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