白塞病（Behcet disease，BD）是一种全身性慢性血管炎症性疾病，具有高度异质性，患者表现为多器官均可受累，包括口腔溃疡、生殖器溃疡、葡萄膜炎和皮肤病变。BD不同器官受累表型的分子特征尚不清楚，疾病诊断主要取决于临床症状。目前缺乏可用于临床诊断、病情评估以及区分不同临床表型BD的生物标志物。

2023年3月，北京协和医院检验科李永哲研究员团队、风湿免疫科郑文洁主任医师团队联合国家蛋白质科学中心于晓波研究员团队在Arthritis Rheumatol（IF=15.483）上发表题为“Proteomics Landscape Mapping of Organ-Resolved Behçet's Disease Using In-Depth Plasma Proteomics for Identifying Hyaluronic Binding Protein 2 Expression Associated With Vascular Involvement”的白塞病相关研究成果。该研究使用深度蛋白质组学（DIA质谱技术联合蛋白芯片技术）首次绘制了白塞病不同表型的血浆蛋白质组学图谱，鉴定并验证了血管受累相关生物标志物，并为白塞病患者的临床评估和治疗提供了有价值的见解。

基于数据非依赖采集质谱（DIA-MS）和抗体芯片联合构建的深度蛋白质组学检测技术平台，研究团队首次对多种表型的BD患者组和健康对照组进行了血浆蛋白质组检测，分析了差异蛋白的功能，构建了疾病表型特异性蛋白质图谱，进行了新型候选标志物的验证。

1、发现队列纳入98例BD患者（其中轻度、中度和重度BD分别为45、38和15例）和31例健康对照者。使用DIA-MS和抗体微阵列对BD进行全面的血浆蛋白质组分析

2、生物信息学分析用于识别BD组中差异蛋白的的生物学机制，并构建器官分辨BD的蛋白质组学景观。

3、候选血浆生物标志物在BD患者（108例）和健康对照（29例）的独立队列中使用ELISA进行验证。

1、DIA-MS和抗体微阵列深入分析BD的血浆蛋白质组

基于DIA质谱技术联合蛋白芯片技术的血浆蛋白质组学平台（图1A），鉴定了759种蛋白质，这些蛋白质包括410种蛋白质生物标志物（Human Disease Plasma Protein Biomarker Database，HDPP）和388个目前已获批或正在进行临床试验研究的治疗靶点（Therapeutic Target Database，TTD）（图1B）。这些生物标志物和治疗靶标的功能注释表明，这些蛋白质属于各种自身免疫和自身炎症性疾病，包括 BD、狼疮性肾炎、强直性脊柱炎和血管炎（图1C、1D）。这些结果表明，检测到的血浆蛋白与BD的发生发展密切相关。

图1 全面的血浆蛋白质组分析流程

2、与BD相关的差异表达血浆蛋白的全蛋白质组分析

DIA-MS共靶向493种蛋白质，去掉缺失值较多的蛋白后，379种蛋白质被保留，去除36种可能被血细胞污染的蛋白质后，343种蛋白质进行分析，其中166种蛋白质在BD组和健康对照组之间显示出显著统计学差异（图2A）。抗体微阵列检测到549种蛋白质，去除5个对照蛋白后，保留544种蛋白用于进一步分析，其中74种蛋白质在BD组和健康对照组之间显示出统计学差异（图2B）。联合DIA-MS和抗体微阵列的深度蛋白质组学显示，总共759种蛋白质中的220种在BD组和健康对照组之间表达有显著差异，比之前报道的多10倍（图2C、2D）。

图2 DIA-MS和抗体微阵列结果

对220种差异表达蛋白（p < 0.05）进行了聚类分析，其中86.0%的BS患者和86.4%的健康者被聚类，而130种差异表达蛋白（p < 0.01）可更好地将88.6%的BS患者和95.5%的HC进行区分（图3A）。利用DisGeNET对疾病的富集分析进一步表明，这些差异表达蛋白质与炎症、自身免疫和血管疾病显著相关（图3B）。利用Cytoscape和ClueGo对220个差异表达蛋白的生物过程进行富集分析，找到BS涉及的主要生物过程：1）补体激活；2）血浆脂蛋白颗粒水平的调节；3）伤口愈合；4）血管生成；5）白细胞介导的免疫；6）肽酶活性；7）细胞活化的正调节；8）白细胞迁移（图3C），这与BS发展过程中的炎症和凝血病理机制相符合。相一致的是，KEGG分析中富集到的最主要通路是补体和凝血级联反应，补体和凝血级联通路中的25种蛋白质有已批准的靶向药物。

图3 差异蛋白的生信分析

3、基于蛋白质组学数据对BD患者进行分型

为了根据蛋白质组学来研究BS患者的异质性，对220种差异表达蛋白进行了无监督一致性聚类分析（图4A）。主成分分析（PCA）显示出亚型I、II、III的明显分离（图4B）。亚型I的特异性蛋白主要参与凝血和补体激活，亚型II的特异性蛋白主要参与葡萄糖和蛋白-脂质代谢，亚型III的特异性蛋白主要参与炎症反应（图4C、D）。亚型I和亚型II相似，具有较高的严重程度，包括神经系统受累和血管受累，而亚型III的症状分布于轻度与中度之间，皮肤损伤占比更高（图4E）。基于临床数据（性别、年龄、严重程度评分和临床表现）对BD队列进行了两步聚类分析将BD患者分为2类（Cluster1和Cluster2），结果表明，蛋白质组学I型和II型分类和临床Cluster1患者具有相似的临床特征，患者表现为多器官（胃肠道、血管和神经系统）受累和较高的疾病严重程度。蛋白质组学亚型III分类和临床Cluster2患者表现出相似的临床特征（图4E、F），结果表明蛋白质组学分型在表明BD患者的异质性和严重程度方面的具有潜在用途。

图4 蛋白质组学数据对BD进行分型

4、BD的不同器官的蛋白质组学图谱构建

BS不同器官受累的蛋白质组特征尚不清楚。作者确定了58种蛋白质在不同器官表型的BS患者组中特异性表达。血管表型具有最多的差异表达蛋白，包括GLUD1、TNC、XCL2等，生物信息学分析进一步表明，这些差异表达蛋白参与血小板脱颗粒、凝血、翻译后蛋白质磷酸化、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性和急性炎症反应等功能。通过对DrugBank数据库的搜索，显示有26种蛋白质（APOA4、CFI、CP、等）是临床应用或在研药物的靶标（图5A）。这些结果为不同器官相关BD的蛋白质组学特征和蛋白靶点的个性化药物开发提供了依据。

图5 BD的不同器官的蛋白质组学图谱构建

5、与BS严重程度相关的血浆蛋白的鉴定

在220个差异表达的蛋白质中，筛选出28个蛋白与BS疾病的严重程度呈正相关，有7种蛋白质（TNC、HABP2、SERPINA3、F5、ATRN、C4B和CFH）与严重程度评分呈线性关系，且在更严重的分组中其表达水平也逐渐升高。随后，作者在由108名BS患者和29名HC组成的独立队列中，利用ELISA验证了7个候选标志物。发现与HC组相比，BS组患者血浆中的HABP2、TNC和SERPINA3含量升高（图6A），同时发现三种蛋白的血浆水平与BS严重程度呈正相关（图6B）。接着根据是否存在静脉血栓、动脉狭窄、闭塞、扩张或动脉瘤，将患者分为血管性BS组（Vascular BS，VBS）和非血管性BS组（Nonvascular BS，N-VBS），发现VBS组中这三种蛋白质显著上调（图6C）。总之，HABP2、TNC、SERPINA3在功能上与炎症、内皮功能和血小板活化相关，可作为BS严重程度和血管受损的生物标志物。

图6 与BS严重程度相关的血浆蛋白的鉴定

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