研究首先比较了速效救心丸和阿托伐他汀钙 （At-Ca）对动脉粥样硬化的治疗作用，发现速效救心丸通过增加心输出量（图1A），而At-Ca主要降低脂质过载（图1B），两者通过不同机制改善临床症状。

图1 SX通过增加心输出量改善动脉粥样硬化

为了确定速效救心丸扩张血管的潜在靶点，研究采用细胞热位移测定（CETSA）+ iTRAQ蛋白质组学技术，将人血管平滑肌细胞（VSMCs）裂解液与1mg/mL的速效救心丸提取物孵育后进行质谱分析，发现199种差异蛋白（142种上调，57种下调）（图2A），其中仅鉴定出一种潜在的靶蛋白CaMKIIδ，通过调节钙信号通路参与心血管收缩（图2B、C）。此外，CETSA验证发现，速效救心丸提取物有效提高CaMKII在人血管平滑肌细胞（VSMCs）中的热稳定性（图2D）。

图2 SX的直接作用靶点CaMKII的发现

随后，通过超高效液相色谱结合CaMKII介导的钙拮抗剂筛选鉴定速效救心丸中的活性药物成分（图 3A）。发现速效救心丸的两个主要成分藁本内酯（Lig）和川芎內酯A（Sen A）通过作用于CaMKII表现出Ca2+抑制活性（图 3B）。由于速效救心丸中的Lig比Sen A更丰富，因此合成了一种炔基修饰的Lig探针及其荧光团示踪剂，用于验证Lig和CaMKII之间的相互作用。对过表达CaMKII的VSMCs进行的凝胶成像分析表明Lig与CaMKII共价结合（图3C）。此外，CETSA 结果也验证了Lig和Sen A与CaMKII的结合（图3D），进一步分子对接（图3E）和点突变（图3F）实验发现Lig与CaMKII的Cys116位点共价结合。

图3 SX的活性成分Lig直接作用于CaMKII

最后，为了验证Lig在体内的血管扩张作用，通过胸超声心动图以检测动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠的收缩功能障碍程度。发现Lig治疗以剂量依赖的方式有效地逆转了心输出量的减少（图 4A），口服Lig后，胸主动脉中磷酸化CaMKII的相对荧光强度显著降低（图 4B）。结果表明Lig通过抑制CaMKII的磷酸化发挥作用。

图4 SX的活性成分Lig改善动脉粥样硬化

总之，作为速效救心丸的关键活性成分，Lig与胸主动脉VSMC中CaMKII的Cys116共价结合，抑制CaMKII的自磷酸化，发挥血管扩张作用。

中药复方的疗效很多都是明确的，但其活性成分和作用靶点大部分都不是很明确。该案例给我们的中药复方研究提供了一个很好的思路：

1）临床样本确定中药复方的疗效；

2）CETSA+ iTRAQ蛋白质组学的方法筛选中药复方的直接作用靶点并验证；

3）明确中药复方中能够与该靶点直接结合的活性成分；

4）动物实验验证该活性成分的作用；

针对于上面关键的第二步，即筛选中药复方的直接作用靶点，除了CETSA+质谱，DARTS+质谱也是可行的方法。若需要筛选中药单体的直接作用靶点，除了上述两种方法，Pulldown+质谱、20K人类蛋白质组芯片也是常用的技术手段。

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