研究人员首先通过表面等离子共振技术（SPR），体外验证了雷公藤红素可以与rhSTAT3（重组人STAT3）直接结合，解离平衡常数KD（M）为15.73 μmol/L（图3A），说明二者具有较强的结合力。为了进一步验证两者的结合作用，研究人员通过竞争ELISA实验证实了生物素标记的雷公藤红素与rhSTAT3的结合现象可以被高浓度的非标记雷公藤红素竞争性抑制，再次证实了雷公藤红素可以与rhSTAT3直接结合（图3B）。

同时，通过pull-down实验，研究人员证实了雷公藤红素与STAT3蛋白在H9C2细胞（图3C）和心肌组织中也直接结合（图3D）。并且在原代心肌细胞中证实雷公藤红素与STAT3上游的蛋白IL-1R、JAK不能结合（图3E）。

图3.雷公藤红素结合靶蛋白验证

为了进一步明确雷公藤红素与STAT3的结合位点，研究人员应用计算机模拟分子对接技术，在CCD和SH2两个STAT3经典domain中对100个氨基酸残基位点进行分子对接模拟，确定了CC domain中的Leu-207残基和SH2 domain中的Gln-635和Val-637残基与雷公藤红素具有最小的结合能（图4A、C），显示该3个氨基酸残基组成的对接位相结构（dock）是雷公藤红素结合和调控STAT3的关键区域（图4B、D）。进一步，研究人员通过氨基酸突变的方式，证实了分子对接模拟的结果，即雷公藤红素确实结合在STAT3的Leu-207、Gln-635和Val-637残基构成的dock中（图4E）。

图4.雷公藤红素与STAT3结合位点确认

为进一步确定雷公藤红素如何通过抑制STAT3治疗心肌肥大的具体机理，研究人员首先构建了STAT3沉默和STAT3过表达的质粒转入原代心肌细胞中，并对其进行AngⅡ和雷公藤红素处理。结果显示，AngⅡ诱导的β-MyHC（肥大标志物）和TGF-β1（纤维化标志物）高表达，在施用雷公藤红素和沉默STAT3后，这些心肌肥大标志物的表达均受到显著抑制（图5A）。同时，在施用雷公藤红素后，STAT3的磷酸化水平也受到了一定程度的抑制（图5B）。

研究人员进一步利用Ang II微泵和主动脉缩减术诱导小鼠心肌细胞异常，将STAT3抑制剂S3I-201 (S3I)和雷公藤红素分别适用于模型小鼠，心脏组织H&E染色结果显示雷公藤红素和S3I均能减弱Ang II引起的的组织病变和心肌细胞肥大(图5C)。

图5.雷公藤红素抑制Ang II引起的心肌肥厚和纤维化

为了进一步了解雷公藤红素是如何影响STAT3而对AngII诱导的心肌细胞异常产生作用的。作者选用Tyr-705位点磷酸化的STAT3蛋白（p-STAT3）作为STAT3激活的标志。研究发现雷公藤红素预处理可以抑制Ang II诱导的原代心肌细胞STAT3 Tyr-705位点磷酸化。由于计算机模拟分子对接中雷公藤红素与STAT3结合的关键氨基酸残基是导致STAT3蛋白发生核移位的关键区域。因此，研究人员通过检测STAT3蛋白在胞核和胞质组分中的表达，发现雷公藤红素可以减少AngII介导的STAT3在原代心肌细胞中向细胞核内的移位(图6A、B)。

前人研究表明，KPNA3蛋白是STAT3核转移的载体蛋白，于是，研究人员在心肌细胞中利用免疫共沉淀技术证实了STAT3与KPNA3确实存在结合，而雷公藤红素可以抑制STAT3-KPNA3复合物的形成（图6C）。由于STAT3入核后会介导一系列与心肌肥大和纤维化相关的基因转录，研究人员利用染色体免疫共沉淀（CHIP）结合RT-PCR技术证实了在初始心肌细胞中STAT3确实可以与myh7、 Col1a和 Tgfb1等基因结合（图6D）。

图6.雷公藤红素抑制STAT3入核调控心肌肥大基因表达

综合上述研究，研究人员通过人类蛋白组芯片技术、表面等离子共振技术及计算机模拟分子对接技术（华盈生物均可提供全套服务）发现了雷公藤红素结合的新靶点STAT3，并通过一系列体外/体内功能实验和Rescue实验，最终明确雷公藤红素是通过结合STAT3的第207位氨基酸，进而抑制了Ang II诱导的STAT3入核发挥转录因子作用（即STAT3与myh7、 Col1a和 Tgfb1等基因结合，介导这些心肌肥厚和纤维化相关基因的表达），来达到治疗和预防高血压性心脏病的药物机理（图7）。