研究者接着利用多种回归性分析和convex analysis of mixtures（CAM）方法鉴别了分别与NL，FS，FP每种表型相关的特征性蛋白。PCA分析也表明这些特征性蛋白可以在LAD组织中区分这3种表型（图2A）。研究者分别比对了LAD和AA组织中FP和NL蛋白组的差异，在LAD和AA组织中分别鉴别了89个和166个差异性蛋白（FC≥ (+/–)1.7; q-value ≤0.05），研究者又通过IPA分析发现了LAD组织差异蛋白的功能与TNF-α通路的激活，以及和胰岛素通路，PPAR-α、PPAR-γ通路的抑制相关（图2B），但是AA组织差异蛋白的功能仅与TNF-α通路的激活有关，与其他通路并没有实质性的关联，说明了胰岛素通路，PPAR-α、PPAR-γ通路相关蛋白的变化或许可以用来鉴别动脉粥样硬化是否发生在LAD或者AA组织。

为了验证组织差异蛋白是否能够成为诊断动脉粥样硬化血浆标志物的来源？研究者在45个女性冠状动脉粥样硬化患者和41个对照女性患者血浆中对组织中38个和FP最显著相关的蛋白进行了MRM-MS分析。其中5个蛋白DRB1, LCP1, RNASE1, MTHFD1和CALU由于在血浆中没有可检测的多肽而剔除，然后研究者利用Skyline软件对剩余33个蛋白的86个多肽的323个碎片进行优化。在对MRM数据分析中，8个蛋白CATB, TSP1, NNMT, S100A9, ITIH2, POSTN, CORO1A和HTRA由于很低的信号比被排除，所以最终25个蛋白被定量作为潜在标志物（图3A）。ROC分析也表明了这些潜在标志物可以很准确的诊断冠状动脉疾病（AUC=0.93）（图3B）。这些结果再次验证了来源于疾病组织的蛋白可以在血浆中被检测，并且早期疾病组织表达的蛋白可以作为疾病诊断的标志物。

这个案例的亮点是通过正常组织筛选蛋白，然后分析和寻找冠状动脉相关的蛋白，最后在血浆中用进行检测。组织蛋白组不仅局限于揭示疾病发生机制，而且还可以作为血浆标志物的来源。这个案例为标志物的研究提供了强有力的证据，先通过组织蛋白组筛选疾病相关的蛋白，然后在病人血浆通过MRM检测。最重要的是这些组织蛋白可以在血浆中被高效的检测到（25/38），这个结果给标志物研究提供了新的启示。

TMT蛋白质谱在动脉中膜和内膜中总共鉴定了6500个蛋白，其中蛋白多肽大于1，在超过60%样本中可被鉴别的蛋白被定量分析，包括动脉中膜总共3079个蛋白，内膜3332个蛋白，其中有2660个蛋白是中膜和内膜共有的蛋白。和健康的动脉中膜相比，FS中膜含有340个差异蛋白，FL中膜含有328个差异蛋白。和FS内膜相比，FL内膜含有577个差异蛋白。功能富集分析发现了中膜和内膜中这些差异的蛋白都显著性富集到补体、脂转运和凝血通路，并且这些通路中蛋白的富集程度会随着疾病的进展而升高，在健康动脉中膜中含量最低，在FS中膜，FL中膜，FS内膜，FL内膜中蛋白丰度依次逐渐升高（图5A）。说明了这些通路蛋白在动脉粥样硬化的发生中发挥着关键作用。另外相关性分析显示了内膜中补体系统蛋白的丰度与其他的通路蛋白丰度间都呈现正相关（图5B），说明补体蛋白的改变可能是一个主导的因素。

研究者接着更深入的分析了补体系统在FL内膜中的变化情况，结果发现了相比其他补体蛋白，“补体激活”相关的蛋白丰度在FL内膜中是最多的（图6A），其中最显著的是C3和C5蛋白（FL内膜 vs FS 内膜，FDR<0.05）（图6B）。研究者选取了C5作为候选标志物验证，首先通过western blotting和免疫组化验证了C5在FL内膜中表达最高（图6C），并且 ELISA也验证C5在FL内膜组织体外培养上清中的含量最高（图6D）。

最后研究者采取利用ELISA方法检测了2个亚临床动脉粥样硬化人群血浆中C5的表达。每一个研究队列都通过影像学分析斑块的数量分为了2组：早期患者（0-2个）和泛发期患者（>2个）。ELISA检测结果表明了泛发期患者血浆中的C5含量显著高于早期患者。通过逻辑回归和多元线性回归分析也说明了C5可作为亚临床动脉粥样硬化独立的预测指标，与斑块负荷和冠状动脉钙化程度具有显著相关性（图7）。

两个精彩的案例为大家勾画出了血浆靶向检测组织蛋白标志物的研究思路和技术路线，大家可以参考将组织样本和血浆或者其他体液样本联合起来研究，这样的标志物研究由于得到了病原组织的证据支持，是更容易被Top期刊接收的。另外，组织蛋白组的筛选还可以为进一步的机制研究提供丰富的数据支撑，可谓是一举两得。好的思路值得华盈视角的解读和推荐，大家可以赶快行动起来了！