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TMT定量蛋白质组学

TMT是由美国Thermo Fisher 公司研发的一种多肽体外标记技术,最多可进行18例样本的蛋白质同批定量分析。TMT试剂由肽结合基团、平衡基团和报告基团三部分组成,可形成18 种等量异位标签。
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       TMT是由美国Thermo Fisher 公司研发的一种多肽体外标记技术,最多可进行18例样本的蛋白质同批定量分析。TMT试剂由肽结合基团、平衡基团和报告基团三部分组成,可形成18 种等量异位标签。具体实验流程及原理如下图:以5例样品的TMT标记定量检测为例。在实验过程中将5例不同样品分别酶解成多肽片段→分别标记5种同位素标签→将5例标记好的多肽样品混合成1例总样品→进行HPLC分级(一般为10-15级)→分级后的多肽组分依次进入LC-MS/MS分析系统→二级MS阶段TMT平衡基团发生中性丢失,在低质量区产生多个报告离子→计算各报告离子峰面积,获得同一肽段不同样品间的相对丰度差异比值→加权计算肽段丰度获得总蛋白质相对定量值。

 

 

|   TMT标记定量技术优势

       从TMT标记定量蛋白质组学技术基本原理和实验流程中我们可以看出,该技术将不同的样本分别标记独立的TMT标签,再等量混合成1例pool样进入质谱分析。这种设计保证了所有样品均一性地经过质谱检测,从而防止了样品依次上样在质谱仪波动期引入的样品间系统误差。因此,一般研究认为TMT标记定量蛋白质组学技术相较于非标记定量蛋白质组学技术,在蛋白质组定量比较方面更加准确。

      同时,由于TMT实验将pool样进行HPLC分级处理,进行多次质谱进样,这样的实验流程不仅将进入质谱中样品的复杂度显著降低,从而减少了背景干扰,提高蛋白检出率。同时,不同HPLC组分中会保留同一蛋白多肽,经过质谱重复鉴定,在定性和定量方面均可提高蛋白质组学的数据准确度,也提高了蛋白质组的鉴定深度。因此,TMT标记定量蛋白质组学对于蛋白质组学深度检测需求的研究尤为适用。

 

|   主要仪器设备

 

|   项目经验

      华盈生物已经完成上百种类型样品的定量蛋白质组学检测,蛋白质组表达具有时空差异性,不同样本的蛋白谱各有特点,下图色块大小代表的是不同样本鉴定的蛋白数量差异。

 

|   样品要求

 

|   应用方向

●   发病机理研究

●   药物靶点研究

●   疾病标志物筛选

●   植物品种改良

●   工程菌改造

●   特殊功能蛋白质筛选

 

|   经典案例

TMT技术发现脂肪代谢紊乱底层机理

2017年5月美国学者Pamir N等运用TMT标记技术成功完成了20例小鼠脂肪组织蛋白质组定量比较。相关研究工作发表在蛋白质组学代表性杂志《Molecular & Cellular Proteomics》上(PMID: 28325852)。该研究实验设计巧妙,突破了iTRAQ和TMT等体外标记蛋白组学技术在同位素标签数量上的限制。

 

TMT蛋白质组学定量研究实验设计

研究人员将8周龄的20只小鼠处理分成四组(每组5只小鼠):分别低脂喂养8周和18周,高脂喂养8周和18周。分别取各小鼠附睾脂肪组织进行3组TMT蛋白质组学定量分析,共计20例样品,通过3套TMT试剂“搭桥”方案完成了蛋白质组学定量分析。3组质谱数据校准后进行组间蛋白谱比较,获得衰老(aging)和高脂饮食(HF)调控的脂肪组织特征蛋白谱,重新认识衰老与高脂饮食诱导的代谢紊乱疾病的物质基础,具体实验设计,见图1。

 

 

图1.多样本TMT蛋白质组学技术路线

 

高脂饮食易造成代谢紊乱

经过18个月高脂饮食喂养,小鼠出现了代谢状态系统性紊乱,随时间增长逐渐加剧。在低脂状态下,衰老是引起代谢紊乱主要因素,但紊乱程度较高脂环境要轻,见图2。

 

图2.高脂饮食和衰老造成糖脂代谢紊乱

 

蛋白质组改变伴随代谢紊乱发生

通过对比分析组间定量蛋白质组学数据的差异,研究人员发现衰老是引起蛋白质组变化的重要因素。而在高脂环境下,衰老对于蛋白质组的调变影响将被放大,表现为代谢相关差异蛋白显著增多。

 

图3.高脂饮食和衰老造成蛋白质组显著调变

 

      TMT定量蛋白质组学数据系统比较了衰老(Aging)和高脂饮食(HF)各自调控的脂肪组织特征蛋白谱,发现:低脂饮食条件下,衰老因素主要通过调控脂代谢、氨基酸代谢相关蛋白群改变引发代谢紊乱。而在高脂环境下,衰老对免疫系统、补体激活、基质重塑等蛋白群又产生了新的影响,造成了更严重的代谢紊乱发生,见如图4。

 

图4.差异蛋白谱互作网络分析

 

小结

通过本文可以看出,蛋白质组学研究具有很大的发展空间,可以填补很多研究知识上的空白。良好的实验设计可以突破技术限制,并让实验数据具有更强的说服力。

 相关文献

[1]. Chen Huang, Lijun Chen, Sara R Savage, et al. Proteogenomic insights into the biology and treatment of HPV-negative head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Cell. 2021 Mar 8;39(3):361-379.e16.2.

[2]. Bo Shen, Xiao Yi, Yaoting Sun, et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera. Cell. 2020 Jul 9;182(1):59-72.e15.

[3]. Karsten Krug, Eric J Jaehnig, Shankha Satpathy, et al. Proteogenomic Landscape of Breast Cancer Tumorigenesis and Targeted Therapy. Cell. 2020 Nov 25;183(5):1436-1456.e31.

[4]. Yongchao Dou, Emily A Kawaler, Daniel Cui Zhou, et al. Proteogenomic Characterization of Endometrial Carcinoma. Cell. 2020 Feb 20;180(4):729-748.e26.

[5]. Michael A Gillette, Shankha Satpathy, Song Cao, et al. Proteogenomic Characterization Reveals Therapeutic Vulnerabilities in Lung Adenocarcinoma. Cell. 2020 Jul 9;182(1):200-225.e35.

[6]. Yi-Ju Chen, Theodoros I Roumeliotis, Ya-Hsuan Chang, et al. Proteogenomics of Non-smoking Lung Cancer in East Asia Delineates Molecular Signatures of Pathogenesis and Progression. Cell. 2020 Jul 9;182(1):226-244.e17.

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[9]. Deanna L Plubell, Phillip A Wilmarth, Yuqi Zhao, et al. Extended multiplexing of TMT labeling reveals age and high fat diet specific proteome changes in mouse epididymal adipose tissue. Mol Cell Proteomics. 2017 May;16(5):873-890.

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发布时间:2021-08-11 17:21:10

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