本研究于2019年发表在Thorax杂志 (IF:9.130)¹。研究者入组了6例特发性肺纤维化 (IPF，Idiopathicpulmonary fibrosis)患者和6例健康受试者（HS，healthy subjects），使用超速离心法分离其痰液中的外泌体。随后，通过miRNA芯片分析鉴定到21个差异表达的miRNA（7个miRNA上调、14个miRNA下调）（图1A），并通过入组10例IPF和8例HS的独立样本（cohort 2），结合前面测序的6例IPF和6例HS（cohort 1），共16例IPF和14例HS，采用qPCR对差异最显著的三种miRNA（miR-33a-5p、miR-142-3p、Let-7d-5p）进行了表达水平的验证。

接着，通过ROC曲线对上述几个差异miRNA进行了诊断效能的评估，考虑年龄和性别（Model1：age and sex），发现联合使用3种miRNA时的AUC达0.978（图1B）。并且外泌体miR-142-3p和let-7d-5p 与IPF患者的肺功能指标一氧化碳/肺泡容积 (DLCO/VA)具有显著相关性。这些结果表明了外泌体miRNA可能用于IPF的检测和诊断。

本研究在今年发表于BriefBioinform杂志（IF:11.620）³。研究者对感染结核分枝杆菌H37Ra（Mycobacterium tuberculosis H37Ra）、牛分枝杆菌BCG （Mycobacterium bovis BCG）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia），以及未感染的THP-1诱导的巨噬细胞（THP-1-derived macrophages）培养基采用超速离心法分离其中的外泌体。随后，通过small RNA-Seq总共鉴定到495个的miRNA。通过比较Exo-Ra、Exo-BCG、Exo-Control，设置fold change > 2.0 或 < 0.5，reads > 200，进行差异表达筛选，发现12个在Exo-Ra组和Exo-BCG组均上调的miRNA和2个在Exo-Ra组和Exo-BCG组均下调的miRNA（图3A）。

随后作者选择miR-185-5p（fold change value >5.0且reads >200的miRNA），通过qPCR发现在THP-1诱导的巨噬细胞和PBMCs中单核细胞感染模型中miR-185-5p在感染组外泌体中上调，同时通过临床血浆样本来源的外泌体（入组20例TB患者、17例健康受试者）也验证了这一结果。最后，通过ROC曲线对外泌体miR-185-5p进行了诊断效能的评估，发现AUC达0.978，敏感性50%，特异性93.75%（图3B）。结果表明外泌体miR-185-5p或可用作结核病诊断的生物标志物。

本研究在2020年发表于Allergy杂志（IF:13.143）⁴。首先，研究人员入组了16例健康受试者（HC，healthy controls）、15例轻中度哮喘患者（AM，mild-to-moderate）、14例重度哮喘患者（AS，severeasthma）。采用尺寸排阻法（Size exclusion chromatography）分离血浆中的外泌体。随后通过small RNA-Seq对血浆中的外泌体进行分析，鉴定到139个的外泌体miRNA（≥10 reads）,其中AM 、AS、HC分别为115、114、128个。此外，AS相较于HC，miR-122-5p、miR-191-5p显著上调，同时miR-3168是显著下调的（图4A、B）。

接着，研究人员每组重新入组了10例独立样本，加上前面入组的用于筛选的样本（HC，n=16；AM，n=15；AS，n=16），共计26例HC、25例AM患者、26例AS患者，通过qPCR对血浆外泌体中上面提到的3种miRNA进行验证，发现miR-122-5p显著上调，miR-191-5p无显著改变，miR-3168未能检测到。最后，作者做了一个试验性质的实验（in a pilotapproach），入组了4例HC、10例哮喘患者（AM或AS），qPCR实验发现其痰液外泌体中miR-122-5p和miR-191-5p也发生显著上调。结果表明miR-122-5p在哮喘患者血浆和痰液外泌体中均显著上调，或可用作哮喘的生物标志物。

1）针对外泌体的分离，上述文章采用了超速离心法、试剂盒法（ExoQuick^™、Exo-Spin™）以及尺寸排阻法（SEC）、这些方法在原理上有所不同，提取外泌体质量方面各有特色，华盈提供包括上述方法在内的多种外泌体提取服务，如华盈生物自主研发的EIQ3试剂盒可以实现血清、血浆、尿液、细胞上清等液质样本中外泌体的快速提取，并且测序数据质量与经典的超速离心最为接近，具体对比数据详见文献“Isolation of extracellular vesicle with differentprecipitation-based methods exerts a tremendous impact on the biomarkeranalysis for clinical plasma samples”。

2）关于差异miRNA的筛选，通常我们会采用商用试剂盒或TRIzol进行外泌体RNA的提取，然后采用Small RNA-Seq或miRNA 芯片的方法确定差异表达的miRNA，以上两种技术策略华盈生物均可以提供。

3）最后关于差异miRNA的验证，虽然文章中应用的是普通qPCR，但是在实际研究中，我们并没有足够的样本进行多个miRNA的验证，一般情况1mL血浆分离的外泌体RNA利用普通qPCR方法仅够3-5个miRNA的验证。而华盈生物提供数字PCR（ddPCR），其反应体系和灵敏度是qPCR的10倍以上，因此，ddPCR特别适用于外泌体miRNA尤其是低丰度RNA表达的验证分析。

4）上述文章能在高分杂志上发表的可能原因：案例1主要特点在于，首先采用痰液的外泌体来检测特发性肺纤维化，痰液样本类型独特。案例2在于其入组患者类型，无人报道过非吸烟者、吸烟者、COPD之间的外泌体差异。案例3在于其细致的生物信息数据挖掘，及临床样本验证，案例4在于其思路完整，样本量相对较多。总之，选择样本类型时，我们可以尝试除血浆外的其他体液，在入组患者时，我们尽量区分不同亚型，在高通量筛选标志物后，我们尽可能进行大样本的验证工作，这些手段都将对提升文章档次有一定的帮助。

华盈生物深耕外泌体领域10余年，可为您提供完备的技术检测服务，包括丰富多样的外泌体的提取及鉴定方法、外泌体体内/外示踪、外泌体功能分子筛选及验证、外泌体机制研究常用的组学或芯片技术服务等（红色为华盈生物特色服务），欢迎电话垂询：400-869-2936。