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《Circulation》:外泌体在心血管疾病中的研究新动向

《Circulation》:外泌体在心血管疾病中的研究新动向

【概要描述】本期华盈视角将解析一篇今年发表在Circulation(IF=29.692)[1]的研究性文章“Extracellular Vesicles from Epicardial Fat Facilitate Atrial Fibrillation”,读者们可结合今年发表在Circulation上的一篇综述“Therapeutic and Diagnostic Translation of Extracellular Vesicles in Cardiovascular Diseases”[2],全面、细致的了解外泌体在心血管疾病研究的最新进展和挑战。

《Circulation》:外泌体在心血管疾病中的研究新动向

【概要描述】本期华盈视角将解析一篇今年发表在Circulation(IF=29.692)[1]的研究性文章“Extracellular Vesicles from Epicardial Fat Facilitate Atrial Fibrillation”,读者们可结合今年发表在Circulation上的一篇综述“Therapeutic and Diagnostic Translation of Extracellular Vesicles in Cardiovascular Diseases”[2],全面、细致的了解外泌体在心血管疾病研究的最新进展和挑战。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:
  • 发布时间:2022-04-25 11:35
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本期华盈视角将解析一篇今年发表在Circulation(IF=29.692)[1]的研究性文章“Extracellular Vesicles from Epicardial Fat Facilitate Atrial Fibrillation”,读者们可结合今年发表在Circulation上的一篇综述“Therapeutic and Diagnostic Translation of Extracellular Vesicles in Cardiovascular Diseases”[2],全面、细致的了解外泌体在心血管疾病研究的最新进展和挑战。

目前,心血管疾病研究的外泌体主要为心肌细胞来源,心外膜脂肪 (eFat,epicardial fat) 衍生的细胞外囊泡(EVs,extracellular vesicles)作用还不清楚。本研究旨在探究eFat-EVs 传递促炎、促纤维化和促心律失常分子诱发的颤动,并对其进行了验证。其思路如下:

01、外泌体分离鉴定

首先,研究人员入组了32例AF(房颤)患者和30例Non-AF患者,分离和培养eFat外植体,发现AF患者较Non-AF患者呈现广泛的炎症和纤维化。作者采用超速离心法(UC,ultracentrifugation)从eFat外植体的培养基中分离了EVs,随后采用NTA鉴定了EVs粒径大小(50-250nm),采用TEM检测EVs形态,并采用Western Blot对EVs标志物(CD63、CD81、TSG101)进行了鉴定,结果符合外泌体特征。

 

02、外泌体数量及外泌体中的细胞因子存在差异

1)外泌体数量差异

作者采用NTA鉴定了EVs粒径大小(50-250nm),并发现Non-AF eFat较AF eFat分泌更多数量的EVs,且慢性AF患者的eFat比阵发性AF或Non-AF的患者分泌更多的EV,表明慢性AF患者的eFat具有更高的生物活性。

 

2)外泌体中细胞因子与游离细胞因子存在差异

作者通过UC法提取eFat外植体的培养基中的EVs,采用luminex技术检测了eFat外植体的培养基中游离的细胞因子及培养基中EVs包含的细胞因子(4个细胞因子IL-6, TNFα, IFNy, IL-10),同时通过ELISA试剂盒检测其他细胞因子(IL-4, VEGF、sFLT-1等)。结果显示,与Non-AF患者相比,来自AF患者的eFat-EV的促炎症和促纤维化的细胞因子(IL-1α、IL-6、IL-4、IL-10)以及脂联素的含量更高,同时,来自AF患者的eFat-EV含有更低水平的IL-10、VEGF、sFLT-1。针对于培养基中游离的细胞因子,与Non-AF患者相比,来自AF患者的游离IL-6、IL-10、VEGF和脂联素的含量无明显差异。最后,作者通过比较游离细胞因子和EVs中的细胞因子含量发现,培养基中和EVs中的很多的细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10、PDGF等)无明显的相关性。

 

 

03、不同分离方法对外泌体特征(数量、粒径、细胞因子、蛋白)的影响

为了避免超速离心法(UC,ultracentrifugation)分离EV可能会导致的非囊泡大分子污染,从而导致样品纯度降低并可能影响下游分析,作者同时采用了尺寸排阻法(SEC,size exclusion chromatography)纯化并富集EV,并比较了两种方法提取的EVs的数量、粒径、细胞因子、蛋白的差异。

 

1)SEC方法分离外泌体的数量及粒径

作者使用 NTA(nanoparticle tracking analysis)分析了36个组分中颗粒、蛋白质和脂蛋白的浓度,结果显示颗粒在2-18组分和19-25组分中被洗脱,且与19-25组分相比,1-18中颗粒的数量和尺寸更大,其中大多数EV的范围在50-150 nm之间,来自AF患者和Non-AF患者的eFat-EV之间具有不同的大小分布。同时,作者对2-18组分进行TEM以及纳米流式检测,结果表明形态符合外泌体典型特征,且表达外泌体标志蛋白CD63,外泌体纯度大于> 60%。而组分19-25被蛋白质污染并含有大量VLDL/LDL和HDL。

 

2)SEC法和UC方法分离外泌体的细胞因子差异

作者重新分析了纯化(SEC)和未纯化(UC)eFat-EV中的几种代表性细胞因子。发现与Non-AF患者相比,来自AF患者的纯化和未纯化的eFat-EV都携带大量的促炎细胞因子,如 IL-1α、促纤维化细胞因子,如骨桥蛋白,以及保护性脂肪因子脂联素。

总的来说,在EV纯化后保留了来自AF患者的eFat-EV的独特特征。

 

 

3)SEC法和UC方法分离外泌体的蛋白差异

作者通过蛋白质组学分析来自AF患者的纯化(SEC)和未纯化(UC)eFat-EVs的独特蛋白特征,确定EVs中可能导致所观察到的纤维化、血管生成和折返性心律失常的潜在候选蛋白质成分。结果显示,在Non-AF患者的未纯化EV中发现了更丰富的蛋白质,在581种定量蛋白质中,206 种 (35.5%) 在AF中的丰度更高和 375 (64.5%) 在Non-AF中具有更高的丰度。为了排除受污染的蛋白质对MS数据解释的影响,作者通过SEC用纯化的EV重复了MS分析,并确认消除了许多蛋白质。在371种定量蛋白质中,确定了259(70%)种在AF患者的eFat-EV中丰度更高,112(30%)种在非房颤患者的eFat-EV中丰度更高。PANTHER 分类系统显示,与心房纤维化、血管生成、细胞凋亡和肌病相关的几种途径仅在来自AF患者的纯化eFat-EV中表达。

 

 

04、不同分离方法对外泌体功能(促纤维化、促血管生成)的影响

内皮细胞(Ecs,endothelial cells)在心房纤维化和AF的发病机制中起重要作用。首先作者通过荧光染料PKH26标记的eFat-EVs,与人脐带血管内皮细胞一起孵育,发现eFat-EVs可以被内皮细胞摄取。为了确定 eFat-EV 的血管生成影响,作者使用了血管生成试验。在纯化(UC)之前,与Non-AF患者相比,来自AF患者的eFat-EV具有更大的促血管生成能力。基于SEC的纯化后,来自AF患者的eFat-EVs,与未纯化的EVs(UC) 相比,在用纯化的EVs(SEC)处理后,促血管生成能力减弱。说明UC收集的外泌体作用效果很大一部分来自于污染的蛋白总的来说,结果表明eFat-EVs被有效地转运到人类ECs中并刺激血管生成。

 

总之,研究揭示了eFat促进心房肌病和颤动发展的另一条途径,即AF患者的eFat会分泌大量EV,这些EV具有独特的促炎、促纤维化和促心律失常特征。

 

 

 

| 华盈视角

该研究遵循了外泌体研究的一般流程,且使用了多种外泌体研究的常规技术手段,我们对其进行了一些点评:

 

1)外泌体分离

文章采用了2种方法:1)超速离心法;2)SEC法。其中,SEC法拥有更高的外泌体纯度。高纯度的外泌体进行下游研究成为相关领域科研工作者的迫切需求,华盈生物根据科研实际,重点推出了高纯度外泌体分离技术qEV系列产品。qEV是一种根据SEC原理设计的一体化外泌体分离/纯化技术,其有效地避免了传统离心方法在分离外泌体时,由于超高离心力与蔗糖溶液高粘性造成的高丰度蛋白包裹及囊泡聚集的污染,也有效避免了传统方法对于外泌体的膜结构的损伤,全面保留了外泌体的生物活性,可用于外泌体功能实验。

 

2)外泌体鉴定

文章采用了NTA、TEM、WB,还采用了纳米流式技术。在进行WB鉴定的时候,研究检测了3个外泌体的阳参CD63、CD81、TSG101,最好是加上外泌体阴参,如内质网蛋白Calnexin和GRP94或线粒体蛋白Cytochrome c等。文章采用的纳米流式技术,对于EVs等复杂样本,使用多种方法反复验证纳米颗粒的粒径和浓度分布结果可以帮助实验人员对未知样本有更好的认识。华盈生物可以提供包括NTA、TRPS和纳米流式多种检测技术。

 

3)外泌体标记

文章采用了PKH26进行体外示踪实验;若能加上体内示踪实验,结果将更具说服力。华盈生物提供多样化的外泌体示踪服务,针对于细胞实验,推荐PKH26/PKH67、Dio、花青素、DiR等,通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞,细胞毒性较小,荧光背景低,脂溶性高,能够穿透细胞膜,有着强而稳定的荧光。针对于动物实验,推荐DiR,DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织,在活体成像中用来示踪,两个18-碳链插入到细胞膜,从而特定的、稳定的细胞染色,几乎不会发生细胞间的染料转移,背景干净,可以避免生物体内在可见光范围内自发荧光造成的背景。

 

4)外泌体细胞因子检测

文章中采用了Luminex芯片来检测外泌体中和细胞上清中的细胞因子;针对于外泌体、细胞上清、血清血浆等样本,我们通常会检测其炎症因子、趋化因子等细胞因子的水平,华盈生物拥有“高通量抗体芯片”、“Luminex液相悬浮芯片”、单分子高敏Simoa技术”三个细胞因子“一站式”服务平台,三平台各具优势,经过华盈生物有机组合,可满足细胞因子检测的全方位需求。

 

5)外泌体蛋白检测

文章中采用了蛋白质组学来检测Non-AF eFat和AF eFat分泌的EVs中差异蛋白。在进行机制研究时,通常采用蛋白质组学的方法检测外泌体中的功能蛋白,通过差异情况和文献调研锁定功能蛋白,提供WB或MRM对蛋白进行验证后,深入研究其作用机制。文章只确定了Non-AF eFat和AF eFat分泌的EVs中差异蛋白以及进行相关的生物信息学分析,尚未进行蛋白的确认、验证和外泌体蛋白机制研究,而只进行了外泌体功能研究,可进一步深入细化,如磷酸化抗体芯片检测受体细胞及ECs细胞相关信号通路改变等。

 

| 相关文献

[1] Shaihov-Teper O, Ram E, Ballan N, et al.Extracellular Vesicles from Epicardial Fat Facilitate Atrial Fibrillation.[J]. Circulation, 2021;143:2475–2493

[2] Sahoo S, Adamiak M, Mathiyalagan P, et al.Therapeutic and Diagnostic Translation of Extracellular Vesicles in Cardiovascular Diseases.[J]. Circulation, 2021;143(14):1426-1449.

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