如文中所述，分析生物样本（如体液、血液、细胞培养上清等）的纳米颗粒的实验中，如何将复杂的多分散复合生物样本中的所有组分进行细分，去除杂质和无关因素干扰等问题都是影响后续实验的至关因素。特别是细胞外囊泡（EVs）的浓度和粒径分布等理化性质对于评估EVs的获得和纯化效果至关重要。支撑EVs表型的关键三大支柱分别是尺寸，浓度测量和形态学样貌。其中确定形态学鉴定需要通过观察电镜，而测量EVs的浓度和粒径分布是实验可重复性挑战的第一步。在这项研究中，通过逐步提高复杂性的方式，全面研究了6种不同的技术在测量50-300 nm尺寸范围内不同类型颗粒的性质。

六种应用的技术分别是：多角度动态光散射（MADLS），不对称流场流动分馏与多角度光散射（AF4-MALS），离心液体沉降（CLS），纳米粒子跟踪分析（NTA），可调电阻脉冲传感（TRPS）和高灵敏度纳米流式细胞仪（nFCM）。让我们一起看看他们在各种分析环境中的优势吧：

用NTA，TRPS，nFCM，AF4-MALS和MADLS测量的单峰分布的平均直径与理论结果比较吻合（误差在6％之内）。只有CLS始终得到比理论值较小的结果（误差高达11％），其他研究人员也在先前的比较实验中也发现了类似的差异（Anderson等，2013）。

浓度：与标准颗粒浓度（10¹⁰颗粒/mL）相比，NTA的统计出的总浓度（特别是200 nm和240 nm）偏高；在MADLS却观察到相反的趋势：MADLS更倾向于“低估”大颗粒的颗粒浓度。

1.2 混合样品检测比较

分析浓度时发现：NTA，TRPS，nFCM和AF4-MALS检测待测样品混合物中各个种群相关的平均粒径与标准样品高度相近，CLS则不然。与1.1 单一样品检测中出现的情况一样，CLS测量的尺寸始终小于理论值（偏差约为11％），这可能是由于其是通过粒子布朗运动推算出结果而不是测量其真实值的测量方式导致的误差。

对于基于光散射的测量技术，脂质体常作为制作样本标准颗粒的主要成分（Simonsen, 2016；Valkonen等，2017），因其表面的理化性质（如折射率，表面结构等）相比聚苯乙烯更接近生物样本的膜结构。实验选择了一种商业上可买到的、具有良好特征的单分散的聚乙二醇化脂质体样品（包含三种不同的脂类:胆固醇、HSPC和MPEG-DSPE）作为检测对象，平均理论尺寸为78 nm。

结果显示：所有检测方式得出的脂质体平均浓度（1.87 * 10¹⁴ / ml）与理论值高度相似，平均浓度是使用NTA，TRPS和AF4-MALS进行浓度测量得出的平均值（参见表10）。其中NTA，TRPS和AF4-MALS测得的浓度基本一致（CV = 27％），但nFCM的浓度明显低于所有其他方法（比其他方法低11倍）。其中nFCM的测量值最低，而NTA的测量值最高。

就测量直径而言，NTA，TRPS和AF4-MALS测得的数据均在标准品脂质体尺寸的10％nm的误差范围以内，而nFCM 的尺寸分布则明显偏斜向较小的直径，众数直径为53 nm。对于nFCM朝着较小直径的这种偏移可能是由于使用了二氧化硅纳米颗粒尺寸作为标准品定量，该标准品的折射率比脂质体固体颗粒的折射率更高。

其中需要注意的是，AF4-MALS 粒度分布结果对折射率变化非常敏感。对他来说确定不均匀的生物纳米粒子的折射率并不是一件容易的事，因此由于折射率不确定，浓度测量结果可能具有很高的不确定性。例如，当按目前的方法估计脂质体的折射率为1.45而不是1.392（Matsuzaki等，2000）时，测得的脂质体浓度将从1.3 * 10¹⁴ ml明显降低至1.6 * 10¹³ / ml。因此AF4-MALS 技术并不适合测量脂质体的粒度分布。

脂质体样品也无法通过CLS进行测量，原因是尺寸过较小，并且颗粒之间的密度差异和测量中使用的蔗糖梯度之间的差异很小（数据未显示）。

表11 是对NTA，TRPS，nFCM，CLS和AF4-MALS检测血浆EVs样品的数据。用不同技术测量的EVs浓度之间存在很大差异。为了使结果在各种技术中具有可比性，分别在80-250 nm和50-400 nm两个尺寸范围内分别评估了浓度。nFCM，NTA和TRPS浓度的结果处于相同的数量级，但CLS结果却高出两个数量级，其中NTA测得的EVs浓度最高，而nFCM测得的最低。NTA和TRPS三个重复实验中取平均值，CV分别为19％和1％。

实验缺少使用MADLS和AF4-MALS对EVs的测量数据，因为MADLS无法解析EVs大小范围内的多分散样品的粒度分布，虽然是按照Zhang＆Lyden文中所描述的AF4-MALS方法对EV进行测量，但也许因为本实验所用样本浓度过低导致回收率始终达不到70%。

本研究通过对聚苯乙烯标准样品（粒度范围：50-300 nm）的检测显示，上述六种方法都可以计算出粒度的分布，并且这几种不同方法测得的结果都有很高的相似性（相似度在90％之内）。但是，在某些情况下，有一些粒度检测方法需要应用复杂的数理统计计算颗粒浓度，例如CLS的手动基线减法，或使用为AF4-MALS开发的新型粒度分布计算算法。但当样本变得复杂，某些方式提供的结果就开始变得不太准确，例如CLS和AF4-MALS在其浓度测量范围内无法检测到较小的种群。总而言之：就复杂混合物的分辨力而言，nFCM，TRPS，CLS和AF4-MALS的性能较优越，而MADLS无法解决多峰混合物，而NTA需要通过检测后的一些处理方式来估算在混合样本中重叠的各种种群的百分比分布。

用上述方法鉴定脂质体标准样本的结果显示，NTA，TRPS和AF4-MALS测得的浓度和粒径分布非常一致（方差系数为27％），而nFCM测得的浓度明显低于所有其他方法（比其他方法低11倍）。其中NTA，TRPS和AF-MALS测得的平均浓度与理论值非常接近（误差15％以内）。

复杂生物样本细胞外囊泡EVs的测量一直是最具挑战性的。对于NTA，TRPS和nFCM而言，测得的浓度和尺寸分布（尺寸范围在80-250 nm之间当样本）都在一个数量级之内，这表明NTA，TRPS和nFCM等单颗粒分析技术非常适合于测量诸如EVs等生物样品；CLS与单上述颗粒分析技术相比，测得的浓度明显偏高；对于AF4-MALS，其测得的浓度低于可接受阈值，在测量生物样本上该技术需要进一步地改进。

对于EVs等复杂样本，使用多种方法反复验证纳米颗粒的粒径和浓度分布结果可以帮助实验人员对未知样本有更好的认识。

其中公认的一个结论是，NTA测量EVs的数值偏大，纳米流式的结果偏小，TRPS的结果在以上几种方法中最接近于真实值。考虑到可能的原因是基于光学原理的测量方法对于囊泡类生物样本的测量会受其表面的结构差异产生与实验无关的光学测量偏差。

因此对于EVs等样本，采用非基于光学的测量方式（如TRPS）无疑是最合适选择。