图1.外泌体标志物研究分组

研究者首先对分离的血浆外泌体进行电镜，NTA和Western bloting验证分析（图2a-c），之后通过LC-MS/MS蛋白质谱技术对外泌体开展蛋白质组学分析。外泌体标志物发现阶段，研究者对5个慢性期病人和5个进展性病人分别按照以上2个时间段收集病人的血浆外泌体开展蛋白质谱研究，利用FunRich软件对质谱结果进行蛋白-蛋白互作分析，发现在进展性晚期病人外泌体中特异性高度富集炎症，氧化应激，细胞生长和凋亡，肿瘤增殖以及淋巴细胞侵袭相关通路的蛋白（图2d，箭头指示）。说明外泌体中的这些通路蛋白高度表达与CLL的进展有关。为了进一步揭示外泌体中与CLL的进展相关的关键蛋白，研究者利用PatternLab软件以及更严谨的准则筛选在进展性晚期特异性表达的外泌体蛋白，最后发现了10个这种特异性蛋白,其中JUP和S100-A9的差异最显著（图2e）， 之后Western bloting也验证了JUP和S100-A9高表达在5个进展性病人晚期血浆外泌体而不是前期，同样在5个慢性期病人诊断阶段和4年后的血浆外泌体都没有表达（图2e）。因为S100-A9参与炎症反应，是调控肿瘤生长和转移的关键因子，研究者将S100-A9作为待选标志物验证。

囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）是由CFTR基因突变导致的进行性遗传病。随着年龄增加并发症的风险也会提高。CF会造成持续性的呼吸道感染，最终导致呼吸衰竭。已有研究表明在CF病人中过量的中性粒细胞征募到肺部会诱导炎症性肺部损伤。但是CFTR活性减少是怎样造成这些炎症反应的并不清楚。本案例的研究者认为外泌体在肺部炎症中可能执行重要作用。所以研究者利用CF肺表皮细胞系（CFTR基因突变）和不同年龄阶段CF病人支气管肺泡灌洗液（BALF）开展了外泌体的研究。相关成果2020年发表于Thorax杂志（8.834）。

图4. 外泌体计数标志物分组

为了证实CF中外泌体数量变化与CF的直接相关性，是不是直接由于CFTR活性改变而导致的，研究者首先利用治疗CF的药物鲁玛卡托（lumacaftor），特扎卡托（tezacaftor ）和伊伐卡托(ivacaftor )处理2种CF肺表皮细胞系（CFBE41,CuFi-5）来恢复CFTR的表达（图6a-b,左），结果表明药物处理后的CF肺表皮细胞系（CFBE41,CuFi-5）上清中的外泌体数量会显著减少（图6a-b,右）。这说明CFTR活性降低直接导致了细胞分泌的外泌体数量增多。然后研究者比对了4个CF病人处理伊伐卡托前后BALF中外泌体数量，结果发现处理后的CF病人BALF中外泌体数量减少（图6c），但是没有显著性。可能因为样本数量太少，所以要想对CF病人BALF中外泌体数量作为标志物研究，还需要大量样本的独立验证。所以在这些小样本研究的前期基础上，要发高分文章还是要研究外泌体的功能机制。

虽然研究者想要研究CF中外泌体和炎症间的关系，但是从哪里入手？研究者果断采取了蛋白质谱技术对外泌体进行蛋白组学研究，分析CF外泌体中有哪些蛋白质，然后推测验证外泌体在CF中的作用。研究者利用label free蛋白质谱技术分析了CF肺表皮细胞系CFBE41和正常肺表皮细胞系HBE41上清外泌体中的蛋白质（图7a），IPA分析发现CFBE41外泌体中的差异蛋白很多富集到免疫相关通路和整合素信号通路上。对CFBE41外泌体中上调最显著的10个蛋白分析，发现它们与中性粒细胞脱粒，补体和整合素相关（图7b），Western bloting也验证了3个显著的蛋白VCAM, EPCAM, S100-A12在2种CF肺表皮细胞系（CFBE41,CuFi-5）上清外泌体中的都显著性上调，和质谱结果一致（图7c），其中最显著的是S100-A12蛋白（图7b,c,红色箭头）。然后研究者对总共20个不同年龄段CF病人BALF中的外泌体和10个正常人BALF中的外泌体进行蛋白质谱分析（图7d）。结果发现CF病人BALF中的外泌体蛋白很高的富集在中性粒细胞脱粒，补体等通路上（图7e）。然后研究者比对了CF疾病进展中各个年龄段BALF中外泌体蛋白的差异，研究者将1-2岁CF（group1）病人组分别和5-6岁组(group2)，8-11岁组(group3)，大于18岁组(group4)相比，分别有45，116和42个显著差异蛋白。并且group3和group4中S100-A12都显著上调（图7f,红色箭头），这个结果和细胞上清外泌体质谱结果一致，说明外泌体高表达S100-A12可能与CF的进展相关。

图7. 外泌体蛋白质组学

蛋白组学已经揭示了CF中外泌体富含和中性粒细胞相关的蛋白，所以研究者聚焦在外泌体和中性粒细胞间的关系上。研究者验证了从健康者和CF病人全血分离的中性粒细胞都可以摄取标记的CFBE41上清外泌体（图8a）。和HBE41上清外泌体相比， CFBE41上清外泌体可以显著增加健康者中性粒细胞活性和迁移率（图8b）。CF病人（13-17岁）的中性粒细胞经CFBE41上清外泌体处理后，迁移率会显著高于健康者和低年龄段CF病人（2-4岁）（图8c）。这些结果说明CF肺表皮细胞来源的外泌体可以促进中性粒细胞迁移和提高其活性，随着疾病进展这种效果会更加明显。那么外泌体调控中性粒细胞的机制是什么？来自于质谱结果提供了重要线索，因为S100-A12高表达在CF外泌体中，研究者推测外泌体的功能依靠S100-A12介导的信号通路实现的。研究者发现CFBE41上清外泌体处理的中性粒细胞会显著增加S100-A12的受体RAGE和下游效应蛋白磷酸化p38，磷酸化p44的表达（图8d），CFBE41细胞中沉默S100-A12后，上清外泌体对中性粒细胞的作用效应会显著下降（图8f）。这些结果说明CF中肺表皮细胞分泌的外泌体对中性粒细胞的作用效能依赖于S100-A12/RAGE信号通路。

这两篇文章都是先用小样本量开展外泌体标志物的研究，然后，在筛选到外泌体计数差异或者蛋白差异后，并没有进行传统标志物的大样本验证。而是通过基于外泌体蛋白质组学的方法开展了功能研究。两个研究都按照相似的方案去揭示外泌体的作用机制：首先确定外泌体的供体细胞和受体细胞，然后根据蛋白组筛选的差异蛋白分析作用机制，最后验证信号通路是外泌体发挥作用的机制。由此可见外泌体蛋白质功能机制的研究并不是很难，只要找准了关键蛋白，之后进行蛋白互作分析和信号通路分析验证机制。华盈视角依据两个案例的研究思路为大家总结了如下技术路线，供大家参考：

华盈生物在外泌体领域，经过多年的深耕与发展，逐渐形成了一套完整的科研服务体系，服务涵盖：提取、鉴定、分析及试剂耗材等领域。经过多年发展，华盈生物的外泌体业务在国内享有较高的声誉。但我们不止于此，近两年我们积极与国际知名外泌体研发企业合作，引入不同的仪器、试剂、耗材，为广大科研工作者的研究更添一臂之力。

1. Daniel Prieto, Natalia Sotelo, Noé Seija et al., S100-A9 protein in exosomes from chronic lymphocytic leukemia cells promotes NF-κB activity during disease progression.[J].Blood.2017,130(6):777-788. 

2. Zivile Useckaite, Mark P Ward, Anne Trappe et al., Increased extracellular vesicles mediate inflammatory signalling in cystic fibrosis.[J]. Thorax.2020;75(6):449-458.