​肾脏纤维化是慢性肾脏疾病(CKDS)的常见结局，最终将导致肾功能障碍。然而，目前还没有针对这一病理过程的有效治疗方法。黄芫花是我国特有植物，已被广泛用作民间药物治疗肾脏疾病相关的水肿，其中二萜类化合物是含量较高且最具药用价值的天然小分子化合物之一。

2024年1月19日，中山大学周怡教授与尹胜教授团队合作在Adv Sci（IF=15.1）发表题为“A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42-mediated GSK-3β/β-catenin Signaling”的文章。发现黄芫花中的一个具有强效抗肾纤维化活性的瑞香烷型二萜小分子Daphnepedunin A（DA），并证实其直接作用靶点为细胞分裂周期蛋白42（Cdc42）。

首先作者观察到黄芫花的粗提物（CE）能够显著减轻小鼠的肾脏纤维化（图1A），接着用萃取法分离CE后发现，许多分离出的化合物均显示出抑制α-SMA表达的能力，其中化合物daphnepedunin A（DA）的活性最强（图1B），并且DA对纤连蛋白和I型胶原蛋白的抑制也最强。与目前正在进行Ⅱ期临床试验的抗肾纤维化药物吡非尼酮（PFD）相比，DA对TGF-β1诱导的肾成纤维细胞的活化抑制作用更强。

图1 DA是一种有效的肾成纤维细胞激活抑制剂

作者首先采用热蛋白质组分析技术（TPP）筛选出Uba5、Igf2bp1、Cdc42、Dctn1和Plod2这5个潜在靶蛋白（图2A）。首先排除掉同时表现出热力学稳定性和不稳定趋势的Plod2，进一步通过FC值大小筛选出Uba5、Cdc42和Dctn1。接着分别敲低验证发现Cdc42可能是DA的靶标蛋白（图2B）。通过HPLC-MS/MS分析检测细胞内组分，发现与DA共孵育的肾成纤维细胞中存在大量DA，说明DA可以被细胞摄取（图2C），接着使用CETSA、SPR验证了DA和Cdc42的结合（图2D-E）。活性Cdc42的水平可以通过GTP-Cdc42的量来指示。作者通过pull-down实验检测肾成纤维细胞中的GTP-Cdc42，并发现DA有效地阻断TGF-β1诱导的GTP-Cdc42的上调，表明该化合物可以减少活性Cdc42（图2F）。接着使用分子对接预测了结合位点（图2G）,并用CETSA检测了不同突变体Cdc42与DA的相互作用（图2H）。

图2 DA的直接靶点探索

作者发现DA和Cdc42抑制剂ZCL278均能显著下调肾成纤维细胞中的纤维化相关蛋白（图3A）。DA对纤维化标志物的抑制作用在敲低Cdc42去除后被削弱，表明DA靶向Cdc42以发挥其抗纤维化作用（图3B），反之，过表达Cdc42促进了肾成纤维细胞的活化（图3C）。此外，Cdc42的敲低减弱了DA对p-PKCβ/p-GSK-3β/β-连环蛋白轴的调节活性（图3D）。Cdc42的过表达启动p-PKCβ/pGSK-3β信号传导，抑制β-catenin的磷酸化并上调β-catenin（图3E）。总之，这些结果说明DA通过靶向Cdc42活性以破坏p-PKCβ/p-GSK-3β/β连环蛋白轴而发挥抗纤维化活性的（图3F）。

DA是从药用植物黄芫花中分离得到的一种天然小分子二萜类化合物，被认为是一种高效的抗纤维化药物，能够阻断小鼠肾脏成纤维细胞的激活，减轻小鼠肾脏纤维化。作者通过TPP实验筛选出DA潜在靶蛋白Cdc42，并使用CETSA、SPR验证了DA和Cdc42的结合，分子对接预测了结合位点并实验验证。在机制上，DA与Cdc42结合并抑制其活性，从而降低下游的p-PKC和p-GSK-3水平，从而导致p--catenin (Ser33/37/Thr41) 上调，并通过泛素-蛋白酶体途径使-catenin降解，从而发挥治疗肾脏纤维化作用。