近期，陆军军医大学新桥医院宋清晓研究员（第一作者）、张曦教授（最后通讯）团队联合美国Emory大学Edmund K. Waller 教授团队（共同通讯）在《Science Translational Medicine》发表了题为"Hypoxia-driven T cell–macrophage–stromal cross-talk sustains fibrosis in preclinical models of cutaneous chronic graft-versus-host disease"的研究论文。该研究整合空间转录组（Visium）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、PhenoCycler-Fusion（PCF，即CODEX）空间单细胞蛋白组和多重免疫荧光（mIHC）等多组学技术，系统解析了皮肤cGVHD纤维化的完整致病链条，并提出了HIF-1α–PI3Kδ–IL-13信号轴作为治疗靶点的转化策略。（华盈生物为该研究提供了PCF空间单细胞蛋白组的检测和数据分析服务）

研究对硬化型cGVHD（Scl-cGVHD）小鼠模型（minor histocompatibility antigen不匹配）和同基因移植对照小鼠皮肤进行Visium空间转录组测序。在对照皮肤中，肌肉、毛囊上皮、表皮、真皮成纤维细胞和巨噬细胞各有明确的空间定位。而在cGVHD皮肤中，空间组织发生显著变化：（1）巨噬细胞扩张与多样化：血管周巨噬细胞和真皮巨噬细胞显著增多。（2）成纤维细胞功能重编程：出现了一群独特的"抗原呈递型成纤维细胞"，共表达髓系/抗原呈递基因和胶原基因。（3）表皮活化与应激：表皮从正常分化程序转向应激/损伤相关的角质形成细胞表型。

巨噬细胞功能模块的空间表达评分进一步表明，对照皮肤中巨噬细胞的M2样、脂质代谢、趋化因子和抗原呈递程序处于低水平且空间局限；而在cGVHD中，这些功能模块在血管周和真皮巨噬细胞中被全面激活，包括基质重塑、泡沫细胞样脂质代谢、趋化因子表达和抗原加工呈递能力的增强。

研究发现了缺氧相关基因主要富集于cGVHD表皮群。GO和KEGG分析显示表皮群中细胞对低氧应答通路的显著激活。氧微传感器直接测量和组织染色在三种模型中均证实了皮肤氧浓度的降低。人cGVHD皮损mIHC证实HIF-1α高表达与免疫细胞浸润增加，与非GVHD对照皮肤形成鲜明对比，为后续深入分析提供了临床相关性基础。

细胞通讯分析揭示了一个核心信号流向：cGVHD表皮细胞 → 血管周巨噬细胞和真皮巨噬细胞。主要信号轴包括：ECM-整合素信号、基质细胞蛋白信号、低氧-血管生成信号、免疫滞留信号等。这些通路均在慢性炎症和纤维化的文献中有明确功能记载，表皮细胞通过这些信号"教育"巨噬细胞，启动促纤维化程序。

研究对7例cGVHD患者和4例非GVHD对照进行空间转录组分析验证。结果显示，（1）M2极化巨噬细胞表达CSF1R、CD163、MRC1、LYVE1，同时检测到COL1A1和COL3A1，提示通过MRC1介导的胶原摄取和加工参与纤维化。（2） 活化促纤维化成纤维细胞表达COL1A1、COL3A1、FBN1、CTHRC1、LOX等基质基因。（3）具有再生潜能的ABCB5+成纤维细胞在cGVHD中丢失。（4）免疫-上皮互作增强：增殖性角质形成细胞、炎症性角质形成细胞与M2巨噬细胞、活化免疫细胞之间的互作增加。

空间转录组发现，与对照相比，cGVHD皮肤中浸润巨噬细胞上调了TLS相关趋化因子和淋巴毒素通路基因。虽然TLS已在多种器官中被描述，但其在皮肤cGVHD中的角色此前未知。小鼠mIHC首先在cGVHD皮肤中观察到淋巴样聚集体，其主要由CD3+ T细胞和F4/80+巨噬细胞组成，CD20+ B细胞极少，这与经典TLS（以B细胞为核心、含生发中心）明显不同。

为在人cGVHD中深入解析这些TLS样结构的细胞组成和空间组织，研究团队采用PCF空间单细胞蛋白组对cGVHD患者皮肤FFPE切片进行高维空间分析。选取包含淋巴细胞聚集和缺氧上皮的多样化组织病理区域（涵盖皮损及邻近非皮损区域）作为感兴趣区域（ROI），对所有ROI进行单细胞分割和聚类分析。PCF panel包含38种蛋白标志物，基于标志物表达和空间定位，PCF鉴定出11种主要免疫和基质细胞群体。

空间分布显示了巨噬细胞和成纤维细胞是包绕T细胞聚集体的主要细胞类型。细胞邻近分析揭示了巨噬细胞与成纤维细胞之间存在强烈的空间互作。CD4+ T细胞和巨噬细胞互作在皮损区域显著高于邻近非皮损区域，表明这一特异性细胞互作参与了cGVHD皮肤纤维化的空间驱动。

在确认了TLS样结构及其细胞组成后，研究转向功能验证：低氧如何影响巨噬细胞？体外实验结果显示，低氧显著增加巨噬细胞MHC-II、CD80、CD86等抗原呈递分子的表达，并且上调IL-1β、IL-10、TGF-β等促纤维化细胞因子。巨噬细胞过继转输功能实验表明，低氧暴露巨噬细胞显著加重了cGVHD。这直接证明：低氧赋予巨噬细胞更强的促纤维化致病活性。

小鼠和人cGVHD皮肤中的通路富集分析共同指向一个促纤维化信号环路，包括HIF-1、PI3K-AKT、type 2免疫、组织重塑，且呈现细胞类型特异性激活模式。mIHC进一步揭示了PI3Kδ在T细胞上表达显著升高，而在巨噬细胞上无显著变化，表明PI3Kδ异常主要源于T细胞区室。血清细胞因子分析发现，cGVHD小鼠IL-13显著升高。胞内染色进一步定位IL-13的主要来源为CD4+ T细胞和巨噬细胞。

研究者开展了深入的机制研究。首先，体外实验验证了IL-13在常氧下即可稳定HIF-1α，呈现正反馈放大机制。皮内注射重组小鼠IL-13显著加重了皮肤cGVHD。相反，抗IL-13单抗治疗减轻了临床和组织学cGVHD，改善了生存。其次，PI3Kδ抑制可以同时减少IL-13产生、缓解缺氧、瓦解TLS样空间结构、逆转巨噬细胞的促纤维化极化。最后，研究开展了靶向HIF-1α–PI3Kδ–IL-13轴的治疗性验证。最终建立了一个完整、可靶向的皮肤cGVHD致病信号轴模型：微血管损伤→皮肤缺氧→T细胞PI3Kδ激活→IL-13产生→角质形成细胞HIF-1α稳定化→IL-13Rα1上调→IL-13敏感性增强（正反馈）→巨噬细胞促纤维化极化→TLS样结构形成→免疫-基质互作→纤维化。

|   PCF空间单细胞蛋白组的核心贡献

本研究中的PhenoCycler-Fusion（38-plex）空间单细胞蛋白组分析为上述致病模型的构建提供了不可替代的空间维度的直接证据：

原位单细胞图谱：在cGVHD患者FFPE组织中实现单细胞分辨率的11种免疫/基质细胞类型注释，保留精准的空间坐标；

TLS样结构的空间解析：揭示了以T细胞-巨噬细胞-成纤维细胞为核心、B细胞极少的非经典TLS空间组织，其CD4+ T细胞-巨噬细胞互作在皮损中特异性富集。

| 参考文献

Song Q, Xu Y, Wang X, et al. Hypoxia-driven T cell–macrophage–stromal cross-talk sustains fibrosis in preclinical models of cutaneous chronic graft-versus-host disease. Sci Transl Med. 2026;18(856):eadx7264. DOI: 10.1126/scitranslmed.adx7264.

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