胶质母细胞瘤（GBM）通常缺乏T细胞浸润，且浸润的少量T细胞多位于血管周围，难以深入肿瘤实质，呈现免疫抑制性微环境。尽管免疫检查点抑制剂在其他癌症中有效，但在GBM的临床试验中效果不佳。因此，开发能够促使T细胞深度且持续浸润肿瘤的方法，是联合免疫治疗的基础。溶瘤病毒因其能选择性在癌细胞中复制并诱导免疫原性细胞死亡，成为一种有前景的策略。近期，《Cell》发表了一项题为“Persistent T cell activation and cytotoxicity against glioblastoma following single oncolytic virus treatment in a clinical trial”的论文。该研究利用前沿的空间组学技术，包括PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组和Xenium空间转录组，联合TCR测序，深入探究了单次注射溶瘤疱疹病毒治疗复发性胶质母细胞瘤后，T细胞在GBM肿瘤中的持续性、功能状态、空间分布及克隆演变。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组对来自16名复发性胶质母细胞瘤患者的配对治疗前活检样本和治疗后切除样本的FFPE切片进行了27种抗体的检测，总计分析了约380万个细胞。诠释了不同的T细胞、B细胞、髓系细胞、血管内皮和肿瘤细胞等。

Xenium对8名患者的配对治疗前后样本进行了分析。Xenium使用了商业化的380-plex基因panel和额外定制的100个探针。定制探针包括了早期T细胞活化标志物，来自TCR测序的50个 “扩增的TCR克隆型”，GBM恶性细胞状态标志物，以及关键的HSV病毒基因。Xenium总计分析了约240万个细胞，定义了11种主要细胞类型，并重点对T细胞进行了功能状态分群。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组揭示了治疗后样本中CD8+和CD4+ T细胞持久地浸润到GFAP+的肿瘤实质中，甚至在治疗后超过6个月至两年以上的样本中依然存在。治疗后T细胞密度中位数显著增加。Xenium识别出多个T细胞功能状态，包括组织驻留型、早期活化型、干细胞样等。治疗后，所有T细胞状态均显著扩增，尤其是组织驻留型和早期活化型CD8+ T细胞。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组直接捕捉到表达颗粒酶B (GZMB+) 的CD8+ T细胞与发生凋亡（cl-Casp3+）的肿瘤细胞在空间上紧密相邻，提供了T细胞介导的肿瘤杀伤的直接证据。高表达GZMB的T细胞密度与高表达cl-Casp3的肿瘤细胞密度呈正相关。颗粒酶B高表达的T细胞与肿瘤细胞之间的距离，与患者的无进展生存期（PFS）和肿瘤生长速率显著相关。距离越短，PFS越长，肿瘤生长越慢。靠近肿瘤细胞的T细胞高表达GZMB、PD-1和CD44（细胞毒性/活化表型），而远离肿瘤、位于淋巴聚集区的T细胞则高表达Ki67（增殖表型）。并且靠近T细胞的肿瘤细胞高表达cl-Casp3（凋亡）、CLEC2D（免疫逃逸配体）和MHC-I（抗原呈递），而远离T细胞的肿瘤细胞高表达CA9（缺氧标志物）。

Xenium在分子表达层面进行了验证，结果发现了表达NR4A1（TCR激活的早期标志物）和CD69的T细胞在空间上与肿瘤细胞紧密接触。Xenium揭示了T细胞的基因表达呈现明确的空间梯度。靠近肿瘤细胞的T细胞高表达组织驻留、细胞毒性和干扰素反应基因。而随着与肿瘤细胞距离增加，干细胞样特征的表达逐渐增强。

细胞邻域分析识别出了功能不同的空间结构区域，如肿瘤-T细胞界面、淋巴聚集区、血管周围区、坏死周围区等。PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组揭示了在“肿瘤-T细胞界面“邻域中的T细胞高表达GZMB，而”淋巴聚集区“的T细胞高表达增殖标志Ki67。类似地，Xenium结果发现了早期活化和组织驻留T细胞富集于“肿瘤-T细胞界面”区域，而干细胞样T细胞则富集于“淋巴聚集区”，与B细胞和树突状细胞密切相互作用。

TCR测序和Xenium空间原位靶向检测揭示了治疗后的T细胞应答主要由治疗前已存在于肿瘤内的T细胞克隆扩增所驱动，而非完全新生的克隆。这些扩增的克隆显著富集于肿瘤组织局部（而非外周血），并且其细胞主要呈现CD8组织驻留型的表型。并且这些扩增的T细胞克隆比未扩增的T细胞更靠近肿瘤细胞。

该研究也发现了病毒蛋白和核酸仅在坏死区域被检测到，且巨噬细胞和中性粒细胞聚集在附近。而活化的T细胞则远离这些病毒残留区域，深度浸润于活的肿瘤组织。这表明在治疗后期，持续的T细胞免疫很可能是由肿瘤抗原而非持续的病毒抗原所驱动。

最后，该研究揭示了溶瘤病毒尽管诱导了T细胞应答，但肿瘤细胞会适应性变化。Xenium鉴定了几种GBM细胞的恶性状态，发现了治疗后具有缺氧特征的间充质样肿瘤细胞比例增加。这些细胞富集于远离T细胞的区域，形成“免疫排斥”区，高表达VEGFA、CA9等缺氧相关分子，可能是导致治疗抵抗的原因之一。

该研究通过整合PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组和Xenium空间转录组，探讨了单次注射溶瘤疱疹病毒治疗复发性胶质母细胞瘤后，如何重塑肿瘤免疫微环境并诱导持久的抗肿瘤免疫的空间机制。PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组提供了 “谁在哪里、在做什么” 的高清单细胞空间地图，特别是细胞相互作用和杀伤事件的直接证据。Xenium则回答了 “它们处于什么分子状态、以及为什么这样分布” 的问题。两者结合，从空间表型到分子机制，层层递进，共同有力地证明了溶瘤病毒治疗可以通过扩增既存的肿瘤反应性T细胞，诱导出深度、持久且具有空间组织性的抗肿瘤免疫，同时也指出了肿瘤微环境重塑（如缺氧）是影响疗效的关键因素，为未来设计联合治疗策略（如联合抗VEGF）提供了科学依据。

| 参考文献

Meylan M, Tian Y, Wu L, Ling AL, Kovarsky D, Barlow GL et al. Persistent T cell activation and cytotoxicity against glioblastoma following single oncolytic virus treatment in a clinical trial. Cell. 2026:S0092-8674(25)01504-1.