慢性髓系白血病（CML）由BCR::ABL1基因突变的白血病干细胞（LSCs）引发。虽然酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）革命性地改善了CML治疗，但TKI耐药性的LSCs在大多数患者中持续存在，阻碍了彻底治愈。这种持续性与骨髓微环境（BMME）密切相关，白血病细胞被认为会破坏正常的HSPC生态位，并生成支持白血病的微环境。近日，血液学顶级杂志《Blood》发表了题为“High-Dimensional Spatiotemporal Single-Cell Atlas and 3D imaging of Bone Marrow Microenvironment during CML Progression”的研究论文。该研究利用PhenoCycler-Fusion (PCF)空间单细胞蛋白组（原CODEX）和3D显微镜，首次在单细胞水平和三维空间尺度上，系统描绘了CML小鼠模型和患者骨髓中发生的动态变化。

这项研究使用了成熟的免疫活性CML小鼠模型（注射BCR::ABL1-GFP转导的细胞）和AML小鼠模型作为对比。PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组使用了54-plex的抗体panel，对野生型（WT）和CML小鼠（诱导后第7、14、21天）的股骨进行分析。共分析了55个感兴趣区域，2,033,725个细胞。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组构建了前所未有的高分辨率小鼠骨髓细胞图谱。研究成功鉴定并注释了 41种不同的细胞类型，不仅包括常见的髓系、淋系、红细胞系细胞，还捕获了稀有祖细胞，如共同单核细胞祖细胞（CoMPs）和早期中性粒细胞祖细胞（eNePs）。从原始红细胞（ProE）到成熟红细胞（EryC）的四个阶段。复杂的间质细胞群体，包括动脉（CD31+Sca-1+）、血窦（CD31+Sca-1-）、LepR+周细胞、骨细胞、脂肪细胞等。多种免疫细胞亚群，如PD-1+的CD4+和CD8+ T细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）等。这为理解骨髓的复杂构成设立了新的“金标准”。

CML进展导致骨髓细胞组成的根本性重塑。随着白血病发展（从第7天到第21天），细胞群体发生显著变化。例如，GFP+白血病细胞和表达免疫抑制分子PD-L1的白血病细胞显著增加。非白血病来源的单核细胞、抗原呈递细胞（APCs）等髓系细胞增多，而B细胞和浆细胞则急剧减少，表明白血病驱动了髓系生成，并以牺牲B淋巴细胞生成为代价。巨核细胞（MKs）数量增加，但更多表达不成熟标志物CD34。一部分MKs为GFP+，表明白血病起源。更重要的是，CML中的MKs形态变得不规则（球形度降低）。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组的空间细胞邻域（CN）分析揭示了微环境的结构性破坏特征。研究构建了14个不同的CNs。这些CNs反映了已知的骨髓结构，如“血管CN”、“骨CN”、“B细胞CN”等。在CML小鼠，特别是晚期，出现了一个由白血病细胞主导的CN-11（白血病CN）。富含B细胞和粒细胞的CNs（CN-2, CN-3, CN-10）以及骨CN（CN-4）在CML中减少或消失。而富含不成熟红细胞（EryB）的CN-7和白血病CN-11则扩张。在早期CML，仅在某些骨髓区域观察到微环境改变的“热点”，而到晚期，所有区域都发生了显著改变。这提示白血病可能从离散的骨髓斑块开始，而非均匀发生。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组发现了T细胞功能耗竭并被招募至白血病区域。虽然总T细胞比例不变，但其组成改变。晚期CML中，PD-1+的CD8+和CD4+ T细胞亚群比例显著增加，提示向免疫抑制表型极化。PD-1+CD8+ T细胞在晚期CML中特异性地富集在白血病CN（CN-11）中，表明白血病区域存在局部化的免疫耗竭。在晚期CML，PD-1+ T细胞更多地与表达PD-L1的抗原呈递细胞（APCs）接触，CD8+ T细胞与白血病细胞接触，这可能是免疫检查点相互作用的基础。造血干细胞/祖细胞（HSPCs）的生态位被破坏。尽管HSPC亚群频率不变，但最主要的CD34+CD117- HSPC群体在CML中细胞尺寸变大，这通常是功能下降的标志。同时，所有HSPC亚群的MHC-II分子表达升高，这与细胞的静息状态相关。在健康和小鼠早期CML中，HSPCs与血窦保持紧密接触。尽管晚期CML血管扩张，HSPCs与血窦的接触却显著减少。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组揭示了巨核细胞（MKs）的结构与功能异常是CML的突出特征。早期CML中，浆细胞样树突状细胞（pDCs）与MKs的接触增加，这与pDCs通过I型干扰素信号调节MKs和血小板生成的报道一致。在人类CML样本中也观察到这一现象。

而在晚期CML中，MKs吞噬粒细胞（称为emperipolesis）的现象增强，被吞噬的主要是非白血病来源的粒细胞。

PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组和3D成像均显示，CML中的MKs形态不规则，球形度和形状因子降低。人类CML活检也观察到同样的MK发育不良。激光显微切割捕获患者的MKs，进行RNA测序。结果发现了新诊断的慢性期CML患者MKs中，有大量与细胞骨架调节相关的基因下调，如MYH9, WDR1, TUBB1, ACTN4, PF4等。这些基因对细胞形态和血小板功能至关重要。这些结果揭示了最不规则的MKs是白血病来源的（GFP+），且GFP+ MKs的比例与MK的形状因子呈负相关。这表明BCR::ABL1癌蛋白直接导致了细胞骨架缺陷。在大多数经过TKI治疗的加速期/急变期CML患者中，这些基因表达变化不明显，且MKs形态更正常。这说明TKI治疗可以逆转BCR::ABL1诱导的细胞骨架缺陷。

最后，3D成像揭示了骨髓病理存在区域特异性。在健康股骨中，血管沿股骨轴整齐排列。而在晚期CML，骨干的血管结构严重破坏，无法辨认模式，且无组织血管体积显著增加。但在骨骺/干骺端区域，血管变化不那么极端。健康MKs均匀分布，而在CML中，MKs在骨骺/干骺端区域异常聚集，密度更高。这表明白血病病理具有显著的空间异质性，局部解剖生态位影响着MKs的分布和形态以及血管重塑。

|   总结与讨论

本研究通过高维PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组和3D成像，提供了非常全面的CML骨髓微环境时空图谱。它深刻地揭示了白血病细胞如何系统性地重塑骨髓。白血病细胞通过上调PD-L1和PD-1，将耗竭的T细胞招募到白血病区域。生成不成熟的、功能紊乱的血管，虽支持白血病细胞，却破坏了正常HSPC的生态位。通过BCR::ABL1直接破坏MKs的细胞骨架，导致其形态和功能异常。

该研究支持了将PD-1/PD-L1抑制剂作为克服T细胞耗竭的策略，并提示血管正常化或可作为治疗方向，针对BCR::ABL1诱导的MK细胞骨架缺陷也可能成为新靶点。

Li L et al.High-Dimensional Spatiotemporal Single-Cell Atlas and 3D imaging of Bone Marrow Microenvironment during CML Progression.Blood 2026; blood.2025029824.