传统上，胶质母细胞瘤（GBM）被认为是一种混乱无序的肿瘤，但经典的神经病理学观察（如Bailey和Scherer在20世纪30年代的工作）已经暗示了其存在某种结构。例如Scherer观察到GBM存在“继发结构”（如围绕神经元的侵袭）、无定形排列、自身模式结构（不依赖于正常脑结构）和围绕坏死的间质反应。这些观察暗示了空间模式的存在，但其分子基础未知。

是否存在跨胶质瘤病理区域的一致组织模式或规则？空间结构在多大程度上决定了细胞状态的多样性？为了回答这些问题，本研究对19例胶质瘤样本进行了Visium空间转录组和Phenocycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组（CODEX）分析，开发了一个定量框架来系统描述胶质瘤空间组织反复出现的特征。

空间转录组学使用了10X Visium平台。关键是每个Visium“点”（spot）的直径为55微米，包含1-35个细胞（中位数8个）。这是一个重要的技术限制，意味着每个点的数据是多个细胞的混合信号，而非单细胞分辨率。研究从空间转录组数据中直接推导出代表细胞状态的14种Metaprogram（MP），包括8个恶性和6个非恶性。非恶性MPs包括了Mac（巨噬/小胶质）、Inflammatory-Mac（炎性巨噬/中性粒）、Oligo（少突胶质）、Vasc（血管）、Neuron（神经元）、Reactive-Ast（反应性星形）。恶性MPs包含了5个核心状态：：MES-like, MES-hypoxia (MES-Hyp), NPC-like, OPC-like, AC-like。

为何需要PCF空间单细胞蛋白组？​ Visium分辨率低，会漏掉稀有或分散的细胞类型/状态（如本研究中Visium无法识别出T细胞、B细胞、细胞周期信号）。PCF空间单细胞蛋白组以单细胞分辨率检测40种蛋白，完美互补。通过对单细胞进行聚类，并基于蛋白标记物进行细胞类型/状态注释，PCF成功识别了所有主要细胞类型和恶性状态，以及Visium无法识别出T细胞和B细胞。

使用STalign软件将PCF和Visium数据（来自相邻切片）进行空间对齐，将PCF单细胞数据聚合到与Visium转录组进行了整合。

研究整合分析了Visium和PCF的数据，揭示了GBM的三维空间组织模式。结果发现了结构化区域呈现五层组织架构，由缺氧梯度驱动。非结构化区域内细胞状态混杂，缺乏缺氧信号。IDH突变型胶质瘤因缺氧缺失而多为非结构化。

研究构建了结构化区域的GBM空间组织分层模型，发现了五层模型：

L1（核心缺氧/坏死）： MES-Hyp。

L2（缺氧相关）： MES-Ast, MES-like, Inflammatory-Mac。这是文章新发现的一层，在传统组织学上无法清晰区分。

L3（血管生成反应/免疫枢纽）： Vasc, Mac, Prolif-Metab, T细胞, B细胞。此层试图应对缺氧。

L4（恶性神经发育状态）： AC-like, OPC-like, NPC-like。缺氧缓解后出现。

L5（脑实质）： Reactive-Ast, Oligo, Neuron。代表浸润的正常脑组织。

与经典组织病理学的对比分析，将分层模型与神经病理学家注释和IVY Gap（基于显微切割的转录组）图谱比较，发现高度一致。例如L1 层对应假栅栏状坏死和坏死（PAN），L3层对应微血管增生（MVP），L4 层对应细胞肿瘤，L5 层对应浸润边缘。但是发现的L2层（缺氧相邻层）是传统方法未能识别的。因此，本研究用细胞状态的高分辨率细节重新定义了经典的组织学特征。

这是一项里程碑式的工作，它通过多组学整合和严谨的计算分析，将胶质母细胞瘤从一个“混乱的细胞集合”提升为一个具有明确空间组织原则的“生态系统”。其提出的 “以缺氧为核心驱动力的五层组织模型”​ 为我们理解肿瘤生物学、肿瘤异质性、治疗抵抗机制提供了全新的框架，并对未来的治疗策略（如针对特定层或层间相互作用）具有深远的启示意义。

|   延伸阅读

PCF凭借对“空间真值”的精准把控，成为空转平台评估的“金标准”——在转录本鉴定与定位精度上，它为关键区域细胞分布锚定“标准答案”，还验证了空转数据稀疏性问题的解决方案；在细胞类型注释准确性上，既从宏观微观双重验证平台性能，又暴露技术局限并追溯根源；在空间聚类性能上，设定“组织模式标尺”区分平台共性与特异性局限。其不可替代性，解决了空转评估“无统一标尺”的行业痛点，建立“以蛋白真值为参照”的评估范式，助力研究者选择适配平台、推动空转技术临床转化。

目前，越来越多的研究都应用PCF空间单细胞蛋白组对空间转录组数据进行验证，从而提升研究结论的可靠性。例如：

PCF空间单细胞蛋白组联合GeoMX DSP揭示非小细胞肺癌免疫治疗的预测标志物

该研究采用的策略是“细胞到基因”：先通过PCF空间单细胞蛋白组学确定有意义的细胞表型，再从其对应的空间转录组数据中提取基因特征，实现了信息的有效衔接。研究首先利用PCF空间单细胞蛋白组数据，在肿瘤和基质区域分别识别与不良预后（耐药）和良好预后（应答）相关的细胞群体，并且分析了细胞间的空间相互作用和微环境结构，阐释了潜在的生物学功能。然后基于上述细胞类型，从空间转录组学数据中衍生出与之对应的基因特征，并在独立的外部队列中验证这些细胞和基因特征的预测能力。

PCF空间单细胞蛋白组联合Visium HD解析星形细胞瘤的肿瘤微环境

该研究分析了1例IME星形细胞瘤亚型复发患者配对的FFPE样本。2个FFPE样本上各选取了一个同时包含肥胖细胞型形态富集和缺少的区域，分别进行了3张邻片的连续切片，中间1张进行了Visium HD空间转录组分析，第1张和第3张进行了PCF空间单细胞蛋白组分析（CODEX），检测了48种抗体。研究利用Visium HD空间转录组进行了细胞邻域分析，通过PCF空间单细胞蛋白组对空转数据进行了验证。

PCF空间单细胞蛋白组联合Xenium发现滤泡性淋巴瘤的预后空间标志物

该研究通过单细胞转录组测序、空间转录组Xenium和PCF空间单细胞蛋白组，首次系统揭示FL滤泡区存在 TFR、TFC4、TFC8三个功能迥异的T细胞亚群，它们形成独特的空间生态位，并通过抑制TFH功能或直接杀伤恶性B细胞发挥抗肿瘤作用。研究利用PCF空间单细胞蛋白组对242 例FL样本进行了28个抗体的检测，构建了多重数字空间数据multiplex digital spatial profiling（MDSP），MDSP的定量分析为FL提供了超越传统指标的预后工具，并揭示了新的治疗靶点。

PCF空间单细胞蛋白组联合CosMx SMI解析弥漫性大B细胞淋巴瘤的空间细胞表型

该研究首次在弥漫性大B细胞淋巴瘤中系统性地定义了7种具有独特细胞组成、空间结构和细胞间通讯模式的“细胞生态位”。研究发现，即使是在免疫豁免部位（如中枢神经系统）发生的淋巴瘤，也存在显著的T细胞浸润和激活，但同时伴有强烈的抑制性信号。这为在这些传统上认为“免疫冷”的肿瘤中应用免疫疗法（如PD-1抑制剂、CAR-T）提供了直接的科学依据。PCF空间单细胞蛋白组在蛋白质水平上证了CosMx SMI在mRNA水平鉴定的主要细胞类型的准确性和可靠性。PCF提供了基于蛋白质表达的细胞表型信息，与转录组数据形成互补。同时PCF成像可以覆盖更大的组织区域（整个组织核心），而CosMx SMI只拍摄选定的视野，PCF提供了更宏观的视野来观察生态位的分布。

华盈生物空间蛋白组客户文章精读

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|   参考文献

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4.Tang J et al. Protein-based classification reveals an immune-hot subtype in IDH mutant astrocytoma with worse prognosis. Cancer Cell. 2025:S1535-6108(25)00363-0.

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6.Dai Y et al. Multi-modal spatial characterization of tumor immune microenvironments identifies targetable inflammatory niches in diffuse large B cell lymphoma. Nat Genet. 2025;57(11):2715-2727.