肿瘤免疫微环境（TME）是一个由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞等组成的复杂生态系统。以往的研究多集中于分析细胞类型（CTs）的组成或两两细胞间的相互作用，这难以捕捉到更高级别的、组织层面的协调行为。本研究通过Phenocycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组（CODEX）分析了结直肠癌（CRC）患者样本，提出了一个创新的分析框架：细胞邻域（Cellular Neighborhoods, CNs）。TME的功能并非单个细胞行为的简单加总，而是由细胞邻域的空间功能单元通过复杂的协同和通信来执行的。

研究对来自35名晚期CRC患者的组织样本进行了检测，包括肿瘤浸润前沿存在三级淋巴结构（TLS）的“克罗恩样反应（CLR）”患者和仅有弥漫性炎症浸润（DII）的患者。通过检测56种蛋白靶标，鉴定了28种细胞类型，包括18个免疫细胞群（如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Treg、B细胞、巨噬细胞亚群、DC、粒细胞等），6个基质/血管群，2个混合群，1个肿瘤细胞群和1个未定义群。

CTs的总体频率在CLR和DII患者间有差异（如CLR患者B细胞更多，DII患者巨噬细胞更多），但CD8+ T细胞和Treg的频率无显著差异。这提示，仅凭某些关键免疫细胞的“数量”不足以解释预后的巨大差异。细胞-细胞接触分析显示，最强的相互作用是同型细胞间的聚集（如B细胞与B细胞），且两组患者间无显著差异。这再次表明，需要更高层次的空间结构分析。

细胞邻域的构建：对于组织中的每一个细胞，找出其最邻近的10个细胞，定义为一个“窗口”。分析这个窗口内28个CTs的组成（即各种细胞类型的比例）。根据所有细胞的窗口组成进行聚类，将具有相似局部细胞组成的窗口归为一类。这些类别就是细胞邻域（CNs）。将每个细胞归属到其窗口所在的CN，从而将整个组织图像划分为不同的CN区域。

假如TME比作一个城市：

细胞（Cells）​ = 城市中的人（如教师、医生、工人）。

细胞类型（Cell Types, CTs）​ = 人的职业（如教师、医生）。

细胞邻域（Cellular Neighborhoods, CNs）​ = 城市的功能区/街区（如住宅区、工业区、商业区）。

每个街区由特定的职业人群组成，并执行独特的功能。街区的功能（如工业产出）远高于其居民职业的简单加总；不同街区之间的协调（如物流）对城市的整体运行至关重要。​ 同理，CNs的行为和相互作用可能比单个CTs更能解释TME的功能。

本研究鉴定出9个保守的CNs：

CN-5（滤泡区）：完美对应已知的TLS，富含B细胞、CD4+ T细胞、DC等。仅在CLR患者中富集。

CN-1（T细胞富集区）、CN-4（巨噬细胞富集区）、CN-9（粒细胞富集区）：代表了之前未被明确定义的非滤泡区亚结构。

CN-2（肿瘤主体区）​ 和 CN-6（肿瘤边界区）：将肿瘤区域进一步细分，后者富含免疫细胞，是肿瘤与免疫交锋的热点。

CN-3/7/8（基质区）：区分了不同的基质结构。

除CN-5（滤泡）外，其他8个CNs在CLR和DII患者中均存在，且频率无显著差异。这表明，CRC的TME共享一套共同的“基础架构”（CNs）。患者预后的差异可能不在于有无这些街区，而在于这些街区的“功能状态”和“街区之间的关系”不同。

研究分析了CNs的功能状态，在已定义的CNs和CTs基础上，分析关键功能性指标（PD-1， ICOS， Ki-67）在T细胞亚群上的表达，并观察这些“功能活化”的细胞在不同CNs中的分布。结果发现了CN-2是“功能热点”，CN-2中的T细胞表达功能性标记（PD-1/ICOS/Ki-67）的比例远高于其他CNs，但以Ki-67+（增殖）为主，ICOS+（活化）比例低，暗示一种功能失调的增殖环境。

利用CN特异性的功能细胞频率（例如“CN-1中的Ki-67+ CD8+ T细胞频率”）来区分CLR和DII患者，比使用整体频率（如“整体Ki-67+ CD8+ T细胞频率”）准确率更高。这说明空间信息至关重要。

在高风险DII患者中，CN-9（粒细胞富集区）中PD-1+ CD4+ T细胞的频率与患者的生存期呈正相关。而该细胞的整体频率或CN-9本身的多少与预后无关。这意味着，这个特定的CN-9的特定功能状态（富含PD-1+ CD4+ T细胞），可能在高风险患者中发挥了关键的积极抗肿瘤作用。​ 这为预后判断和靶向治疗提供了全新的潜在靶点。

对于任意两个CNs，研究分析它们之间功能性T细胞亚群的频率是否存在协同变化。使用典型相关分析（CCA）​ 来量化这种多变量间的关联强度，发现了仅在DII患者中，CN-4（巨噬细胞区）中Treg的频率与CN-1（T细胞区）中细胞毒性T细胞的频率呈负相关，提示存在跨CN的免疫抑制。在CLR患者中，CN-6（肿瘤边界）是枢纽，直接连接CN-1（T细胞区）和CN-2（肿瘤主体），可能促进免疫细胞向肿瘤内部浸润。但是在DII患者中， CN-6与CN-1的连接中断，转而与更具抑制性的CN-4强连接。同时，CN-1和CN-4之间出现直接连接。这仿佛在DII患者中，抗肿瘤免疫的“通路”被肿瘤“改道”，引入了抑制性的检查点。

这项研究是空间生物学领域的一项标杆性工作。基于PCF空间单细胞蛋白组数据，它超越了简单的细胞分类和计数，开创性地提出了“细胞邻域”的功能单元，并利用多维度的计算分析方法，揭示了肿瘤免疫微环境中前所未有的组织原则和动态相互作用。其发现不仅深化了对结直肠癌免疫机制的理解，更重要的是，它提供了一套可推广的系统性研究范式，为未来开发新的生物标志物和联合免疫治疗策略奠定了坚实的基础。

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|   参考文献

Schürch CM et al. Coordinated Cellular Neighborhoods Orchestrate Antitumoral Immunity at the Colorectal Cancer Invasive Front. Cell. 2020;182(5):1341-1359.e19.