目前，头颈鳞状细胞癌（HNSCC）等多种癌症对免疫检查点抑制剂治疗响应的效果有限，根源在于肿瘤的高度异质性，并缺乏预测性生物标志物。为了阐明HNSCC的肿瘤异质性，本项研究利用PhenoCycler-Fusion（PCF）（CODEX）的超高plex（101种蛋白标志物）空间单细胞蛋白组技术，对HNSCC组织进行了前所未有的深度分析，首次在单细胞水平上同时揭示了肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的空间分布、功能状态以及肿瘤细胞自身的代谢和应激状态，并发现同一肿瘤内存在“免疫激活/凋亡”和“肿瘤进展/侵袭”两种截然相反、相互竞争的微环境生态位（Niche），这为理解HNSCC异质性和免疫治疗反应差异提供了全新的视角。

研究首先验证了101-plex抗体panel是可靠且有效的，能够在复杂的人体组织中准确识别不同的细胞类型和结构。构建的panel中包含了不同免疫细胞类型的marker，组织结构和基质细胞的marker，免疫检查点和功能状态marker，以及相关代谢通路中的关键代谢酶。

通过关键的表型marker，对HNSCC数百万个细胞进行注释，鉴定了14种主要的细胞类型。包括肿瘤细胞（表达上皮标志物和PD-L1/PCNA）、各种免疫细胞、血管、食管黏膜下腺（ESMG）等。单细胞空间原位图谱清晰显示了肿瘤区域、正常扁桃体区域和过渡区域。

研究进行了细胞邻域（Cellular Neighborhoods）分析，皆在超越单个细胞类型，分析细胞群体的空间组织模式。在HNSCC样本中识别出6个独特的细胞邻域：

CN1： 肿瘤细胞富集区（78%是肿瘤细胞）。

CN2： 血管和淋巴管富集区。

CN3： CD4+ T细胞富集区。

CN4： B细胞富集区（87%是B细胞），并在肿瘤内部发现了三级淋巴结构（TLS），这是与良好预后和免疫治疗反应相关的“抗肿瘤免疫堡垒”。

CN5： 混合免疫细胞区（含CD8+ T细胞和巨噬细胞），代表免疫细胞浸润肿瘤的区域。

CN6： 正常鳞状上皮区。

细胞邻域分析提供了一个更高层次的、宏观的组织结构视图，有助于理解免疫细胞是如何在空间上被“组织”起来攻击肿瘤的。

为了回答“细胞在做什么？”的问题，而不仅仅是“它们是什么？”，研究进行了功能代谢分型。

从101种标志物中专门挑选出23个与代谢、应激、凋亡、增殖、侵袭相关的蛋白，再次进行无监督聚类。结果鉴定出14种功能表型。当将这些功能表型映射回空间位置时，揭示了显著的瘤内异质性，肿瘤进一步划分为4个功能迥异的区域：

Tumor 1 (T1)： 高比例凋亡细胞（BAK高）。

Tumor 2 (T2)： 中心是凋亡细胞（BAK高），外围是增殖细胞（PCNA高），像一个“被围攻的堡垒”。

Tumor 3 (T3)： “坏”的区域。高表达G6PD（戊糖磷酸途径，介导耐药）、MMP9（侵袭）、CPT1A（脂肪酸代谢，促进肿瘤进展）。

Tumor 4 (T4)： “好”的区域。高表达糖酵解（HK2）、三羧酸循环（ATPA5, SDHA）和凋亡（BAK）标志物。同时，该区域富含CD8+ T细胞和M1巨噬细胞。这表明这是一个免疫激活、能量代谢活跃、正在清除肿瘤细胞的区域。

最后研究将免疫细胞分布（是什么）与代谢功能区域（在做什么）进行了关联分析。研究量化比较了4个肿瘤区域和正常扁桃体的免疫细胞组成。发现T4区域有最高的CD8+ T细胞和M1巨噬细胞浸润，而T3区域则有相对更高的M2巨噬细胞（通常具有免疫抑制和促肿瘤功能）。空间邻近分析发现了在T4区域，M1巨噬细胞和CD8+ T细胞更靠近肿瘤细胞，表明直接的杀伤作用。而在T3区域，M2巨噬细胞更靠近肿瘤细胞，暗示一种促肿瘤的相互作用。比较4个肿瘤区域中细胞邻域（CNs）的分布。T1, T2, T3区域以肿瘤富集邻域（CN1）为主，而T4区域则以混合免疫邻域（CN5）为主，从宏观空间组织上印证了T4区域的免疫活性。

本研究通过超多重的PCF空间单细胞蛋白组学，前所未有地揭示了HNSCC TME在免疫组成、空间组织和代谢功能上的巨大异质性。特别是基于同一肿瘤内并存“抗肿瘤”（T4）和“促肿瘤”（T3）微环境生态位的发现，提出了“同一肿瘤内竞争性微环境”的核心概念，为理解免疫治疗反应的异质性提供了全新的、强有力的解释框架。这暗示未来的治疗策略可能需要考虑这种空间异质性，针对不同的区域采取不同的联合疗法。

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|   参考文献

Jhaveri N et al. Mapping the Spatial Proteome of Head and Neck Tumors: Key Immune Mediators and Metabolic Determinants in the Tumor Microenvironment. GEN Biotechnology. 2023.419-434.