在空间生物学的“微观世界”里，空间转录组（spatial transcriptomics, ST）技术凭借“基因表达 + 空间定位”的双重能力，成为解析细胞互作、组织微环境的核心工具。如今，从测序型到成像型，Stereo-seq v1.3、Visium HD、CosMx 6K、Xenium 5K等商用空转平台不断迭代，亚细胞级分辨率、高通量基因检测已成为主流，但“不同平台的结果谁更可靠？如何判断数据是否贴近生物学真实？”这些关键问题，却始终缺乏统一的“标尺”来衡量。此前的空转技术基准测试，或局限于低分辨率平台，或依赖实验条件不一的公共数据，最大的痛点在于——没有一个能提供“空间真值”的技术，来验证结果的准确性。近期，北京大学曾泽贤团队及解放军总医院孟元光团队发表了一篇题为 “Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors”的研究，就让四款主流高分辨率空转平台“同台比拼”。而在这场竞技中，PhenoCycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组（CODEX），凭借独特优势（对“空间维度”“检测深度”“临床适配性”的极致融合）化身“金牌裁判”，为平台性能评判提供了精准的“金标准”。为何是PCF能担此重任？它凭什么能成为评判顶尖空间转录组平台的“权威标尺”？

研究团队利用3例未接受治疗的结肠腺癌（COAD）、肝癌（HCC）和卵巢癌（OV）临床样本生成多组连续切片，对空间转录组的相邻切片进行了PCF实验，并结合scRNA-seq测序数据，共同构建参考数据集，用于系统评估各空间转录组平台的表现。为确保不同平台间分析结果的一致性，后续所有“bin 水平”分析均采用8微米分辨率。

PCF作为蛋白层面的检测技术，成为评估空转平台转录本定位是否准确的“金标准”，核心优势体现在：

• 精准锚定关键区域细胞类型特征基因分布

在COAD三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures, TLS）样区域，明确B细胞、CD4+/CD8+T 细胞特征基因的真实空间分布，为判断Visium HD、Xenium 5K的一致性优势提供“标准答案”；在HCC血管区，清晰呈现内皮细胞（CD34+）特征基因的血管边缘分布，验证Xenium 5K检测结果的可靠性；在OV中精准识别CD68+ 巨噬细胞特征基因的富集范围，确认所有空转平台基础定位能力。

• 助力“解决空转数据固有缺陷”，提升评估结果可靠性

在COAD选定的类 TLS 感兴趣区域（ROI）中，PCF作为参照，证实细胞类型特征基因集与蛋白分布的一致性显著强于单个标志基因，为空转数据稀疏性问题提供解决方案的“有效性证明”。在特征基因集的全局分析中，PCF再次验证Visium HD、Xenium 5K的一致性优势，与局部评估结果形成呼应，确保空转平台性能评估结论的稳定性和可信度。

• 检测组织结构与基础免疫细胞

在COAD样本中，PCF验证了所有空转平台在捕捉组织结构与细胞组织方式上的强一致性；通过与PCF数据集对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及巨噬细胞的定量结果对比，明确“与PCF一致性越高的平台，免疫细胞识别效果越好”，且PCF数据证实基于成像的空转平台在检测小尺寸淋巴细胞时优于测序的空转平台，为平台类型性能差异提供了精准数据支撑。

• 空间网格细胞计数一致性评估

借助PCF在“空间网格上的细胞类型特异性计数”数据，研究发现Xenium 5K 与PCF的整体一致性最高，尤其在免疫细胞注释上优势显著；同时，PCF也验证了所有平台在上皮细胞（丰度高、分布广）检测上表现相近，说明细胞类型丰度对平台表现的影响，让评估结果更具合理性。

• 淋巴细胞富集区免疫细胞群体区分

以PCF呈现的细胞分布为参照，各空转平台虽能在COAD切片中识别淋巴细胞聚集体并捕捉相关标志基因，但Xenium 5K在识别CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及B细胞时，经PCF验证具备更高有效性与准确性；PCF还暴露了Visium HD的局限：尽管其对部分标志基因检测灵敏度和特异性高，但无法有效区分CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞与浆细胞，而这一缺陷正是通过与PCF “单细胞群体精准定位”对比才得以发现，追溯原因可能是“bin水平分析导致转录本混合”。

空间聚类是识别组织功能性细胞聚集体的关键，而PCF作为蛋白层面的高分辨率检测技术，为空转平台聚类结果提供了唯一“真值参照”。通过与PCF对比，明确“多数空转平台与PCF聚类一致性相近”，但精准识别出HCC样本中stereo-seq v1.3 的聚类一致性较低。

|   总结与讨论

PCF凭借对“空间真值”的精准把控，成为空转平台评估的“金标准”——在转录本鉴定与定位精度上，它为关键区域细胞分布锚定“标准答案”，还验证了空转数据稀疏性问题的解决方案；在细胞类型注释准确性上，既从宏观微观双重验证平台性能，又暴露技术局限并追溯根源；在空间聚类性能上，设定“组织模式标尺”区分平台共性与特异性局限。其不可替代性，解决了空转评估“无统一标尺”的行业痛点，建立“以蛋白真值为参照”的评估范式，助力研究者选择适配平台、推动空转技术临床转化。

Ren P, Zhang R, Wang Y, Zhang P, Luo C, Wang S, et al.Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors.Nat Commun. 2025;16(1):9232.