小分子筛选下游靶点蛋白是药物发现、疾病机制研究以及生物学功能探究中的关键环节。小分子药物结合靶点蛋白的发现，不仅能帮助理解疾病的分子机制，也能指导药物的设计与优化，从而提高药效、减少副作用，并推动精准医疗的发展。

化学蛋白质组学技术相较于传统的蛋白质组学而言，基于一系列功能特异的化学探针，结合蛋白质谱技术，能够鉴定复杂体系中（如活细胞、细胞裂解液或组织裂解液）化合物和蛋白质的相互作用。在小分子的靶点发现、活性化合物筛选和先导化合物结构优化等方面具有重要作用。

在这里，小编汇总整理了5种曾经发表在CNS顶刊上的ABPP衍生技术的原理、特点和应用案例，和达吉特药靶研究粉丝们一起学习。

上述5种ABPP技术，达吉特均建立了完整的技术路线，拥有丰富的实操经验。

ABPP技术是在活性化合物探针与蛋白质组学技术基础上发展而来的小分子钓靶技术。随着科学技术的迅速发展，高通量质谱和点击化学（Click Chemistry）的融合极大提高了分析的灵敏度、分辨率以及化合物探针的生物相容性。基于炔基或光亲和基团标记的ABPP技术目前被广泛应用于化合物结合靶蛋白的筛选与鉴定，为阐明活性化合物的作用机制提供了关键助力。

基于炔基修饰的ABPP技术

技术流程原理：将小分子进行炔基标记后处理细胞，通过简便高效的点击化学反应，将结合上靶点蛋白的炔基小分子连接到带有叠氮的磁珠上，通过磁珠离心获取小分子靶向结合的靶点蛋白。进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白（图1）。

技术优势：相较于生物素标记的钓靶技术，炔基修饰不容易影响小分子的活性以及穿膜效果，可以先用标记炔基的小分子处理活细胞后，再裂解细胞进行点击化学反应，进而进行靶点垂钓。

相关研究解读： 

2025年5月，王继刚教授团队在《MedComn》发表了题为“Inhibition Peroxiredoxin-2 by Capsaicin Ameliorates Rheumatoid Arthritis via ROS-Mediated Apoptosis in Fibroblast-Like Synoviocytes”的研究文章，采用炔基标记的ABPP技术鉴定出天然产物辣椒素的靶点蛋白是过氧化物还原蛋白家族成员PRDX2。辣椒素靶向抑制PRDX2，导致细胞内活性氧水平升高，进而诱导氧化应激和细胞凋亡，从而发挥治疗类风湿性关节炎的作用（图2）。

达吉特公众号在前几期分享过采用炔基标记的ABPP技术进行靶点鉴定的相关研究解读（点击标题可直接跳转到相关推文），具体如下：

1.王继刚团队最新成果：通过ABPP技术揭示了咖啡酸和二氢咖啡酸两种天然产物的抗炎靶点和机理

2.Cell子刊｜中国药科大学李萍/杨华/郑祖国团队发现天然产物麦角甾醇治疗代谢性疾病的直接靶点

基于光亲和基团修饰的ABPP技术

技术流程原理：光亲和ABPP是在炔基标记的点击化学探针基础上引入一个光亲和基团（如二苯甲酮、双吖丙啶等）进行靶点筛选的技术。将光亲和探针与靶细胞共孵育后，会产生高活性自由基中间体，在特定波长的紫外光照射下与靶点蛋白共价结合，再通过点击化学反应将结合上靶点蛋白的小分子探针共价连接到带有叠氮的磁珠上，可以加强靶点蛋白的抓取能力。进一步，再通过磁珠离心获取小分子靶向结合的靶点蛋白并进行质谱检测（图1）。

技术优势：光亲和ABPP的优势在于其灵敏度高，对低丰度蛋白、瞬时结合蛋白和弱结合蛋白检出友好；在活细胞水平进行靶点筛选，保留生理状态下的分子与蛋白相互作用，极大地突破了传统靶筛方法的局限性，为揭示药物与靶点之间瞬时性、非共价相互作用提供了重要工具。

相关研究解读： 

2022年2月，厦门大学生命科学学院林圣彩院士团队在顶级期刊《Nature》上发表了题为“Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2”的研究文章。利用光亲和ABPP技术鉴定治疗2型糖尿病的一线药物——二甲双胍的互作靶蛋白，最终确定二甲双胍直接靶向PEN2，随后介导AMPK信号通路的激活，从而影响细胞中的代谢调节和相关疾病（图3）。

2024年9月，上海交通大学医学院附属瑞金医院王卫庆教授团队同在《Nature》发表了题为“A brain-to-gut signal controls intestinal fat absorption”的研究文章。利用光亲和探针ABPP鉴定天然产物葛根素能够靶向GABRA1调控“脑-肠轴”，直接影响肠道对脂肪的吸收，有望成为治疗肥胖和代谢性疾病的新型药物（图4）。

达吉特公众号在前几期分享过利用光亲和ABPP技术进行靶点鉴定的相关研究解读（点击标题可直接跳转到相关推文），具体如下：

1.Nature 重磅 | 中药天然化合物葛根素成为减肥新帮手，传统中药研究上岸顶刊!

2.iMeta（IF=23.7）| ABPP靶点研究揭开神药青蒿素抗疟之迷

3.APSB: 中科院团队“钓出”大麻二酚抗冰毒成瘾的线粒体靶点

半胱氨酸（Cysteine，Cys）由于其侧链巯基的化学活泼性使其展现出较强的内在活性，是多种蛋白质的功能活性位点。此外，还能够发生多种翻译后修饰的类型，参与诸多生理过程。由此，半胱氨酸已成为共价药物设计的理想结合位点，鉴定小分子在细胞内结合靶蛋白的半胱氨酸位点在药物靶点发现和先导化合物优化的相关研究中具有重要作用（图5）。

由此，在ABPP的基础上，利用碘乙酰胺的炔基衍生化探针（IA-alkyne）鉴定蛋白质组中的反应性半胱氨酸基团的技术应运而生——基于同位素标记串联正交酶水解的活性蛋白质分析技术（isotopic Tandem Orthogonal Protease-activity-based Protein Profiling，isoTOP-ABPP）。基于此研究，升级版的竞争性isoTOP-ABPP技术不仅能够研究蛋白组中具有反应活性的半胱氨酸之外，还能够用于活性小分子化合物所结合的半胱氨酸残基。

技术流程原理：IA-alkyne探针与蛋白质组中半胱氨酸残基中的巯基共价结合，炔基基团通过Click反应与生物素进行偶联，进而实现对靶蛋白的富集，后续利用质谱即可鉴定具有反应活性的半胱氨酸位点。进一步，基于活性小分子化合物与IA-alkyne探针进行竞争标记，最终通过比较实验组和对照组的标记信号差异，即可确定化合物结合的半胱氨酸位点（图6）。

技术优势：isoTOP-ABPP技术能够精准鉴定小分子化合物在复杂蛋白质组中结合靶蛋白的半胱氨酸位点，对于理解药物作用机制和挖掘潜在副作用具有关键作用。此外，还能够定量比较同一化合物对于不同靶点结合位点的占据效率，以评估其选择性，为结构优化提供指导。

相关研究解读：达吉特公众号在前几期分享过isoTOP-ABPP技术的发展历程和相关研究解读（点击标题可直接跳转到相关推文）：3篇Cell，2篇Nature，1篇Science：isoTOP-ABPP凭实力成为最易登上CNS的钓靶技术

在以往的ABPP技术基础上，创新性地将光亲和探针与竞争性结合作用原理相结合，衍生的光亲和标记-竞争性活性蛋白质组学分析Photoaffinity Labeling -Competitive Activity Based Protein Profiling（PAL-cABPP）技术，不仅能够筛选鉴定活性小分子的结合靶点与结合区域信息，还能够针对特定靶点蛋白筛选活性分子。

技术流程原理：根据活性分子结构，将光亲和基团修饰于不同位点，形成活性程度不同的多样化分子探针，再与活细胞进行孵育，筛选鉴定不同探针的结合蛋白，即可综合分析得到该分子的活性靶点、非活性靶点以及潜在毒性靶点，获得全面的分子互作蛋白信息。而针对某特定靶点蛋白，将该蛋白的已知靶向探针与不同的候选活性分子分别进行竞争结合实验，即可筛选出针对该蛋白的靶向性更强的活性分子（图7）。

技术优势：PAL-cABPP技术在活细胞层面定性或定量检测其中几乎所有的活性分子-蛋白质相互作用，能够针对特定靶点蛋白筛选靶向性强的活性分子；此外，还能够全面鉴定小分子的活性靶点与脱靶靶点，有利于揭示活性分子作用的复杂生物机制和经典老药的潜在新用途。

相关研究解读：

PAL-cABPP技术基于传统ABPP的底层逻辑原理，灵活调整实验方案和探针设计策略，能够在活性分子靶点的全面鉴定和针对特定靶点的活性分子筛选两个截然不同的应用方向上大展身手。

2017年1月，斯克利普斯研究所在《Cell》上发表了题为“Ligand and Target Discovery by Fragment-Based Screening in Human Cells”的研究文章。研究者通过对多种活性天然产物和临床药物的活性骨架进行光亲和探针修饰，建立了一个包含14种活性探针的小库，并利用PAL-cABPP技术在HEK293T细胞中测试这些探针的作用。最终鉴定了2000+与这些活性探针相互作用的蛋白质靶标，根据结果确定了具有更优越的蛋白结合能力的化合物。为理解活性小分子片段如何在细胞环境中与蛋白质相互作用提供了新的见解，并为新药发现提供了创新策略。

2022年7月，宁波大学新药技术研究院的倪锋教授团队在《Chemical Communications》发了题为“Evaluation of site-diversified, fully functionalized diazirine probes for chemical proteomic applications”的研究论文，报道了多位点光亲和探针在化学蛋白组学中的潜在应用。通过对EGFR靶向药物共有骨架急性不同位点进行光亲和基团修饰，得到了一组多位点活性探针，并在鉴定了这些探针的互作蛋白谱。在分析评估不同探针的富集情况后，最终实现了全面的分子-蛋白相互作用。

在PAL-cABPP技术基础上，基于ELISA实验体系，结合小分子探针和抗体富集蛋白的作用优势，聚焦于针对蛋白靶点的高通量活性配体筛选，能够在活细胞体系中“以靶筛药”发现更具结合特异性的活性分子。

技术流程原理：ELISA-ABPP技术利用与探针结合位置不同的抗体富集目标蛋白，同时利用连接光亲和基团的探针富集靶点蛋白，并将候选化合物与探针竞争，最后通过探针组与实验组中目标蛋白和探针结合的比值来判断候选化合物与靶蛋白的亲和力。

技术优势：ELISA-ABPP技术能够基于高通量体系，针对特定靶蛋白，在活细胞中实现更加广泛的活性小分子筛选。相较于传统的活性分子筛选策略，ELISA-ABPP技术体系特异性好、活细胞水平能够反映真实的药靶结合情况；相较于isoTOP-ABPP技术，其通量更高，能够适用于大部分靶点蛋白和应用场景。

相关研究解读： 

2021年4月，美国斯克里普斯研究所Cravatt教授团队在《ACS Central Science》上发表了题为“Functionalized Scout Fragments for Site-Specific Covalent Ligand Discovery and Optimization”的研究文章。研究证明了功能化亲电（Scout）片段作为蛋白位点特异性结合探针在化学蛋白质组中的潜在作用。在此基础上，进一步建立了ELISA-ABPP技术，能够针对目标蛋白从包含大量功能化合物库中进行高通量筛选，找到与之结合更为特异的活性分子。

|   总结与讨论

化学蛋白质组学作为化学生物学和蛋白质组学交叉融合产生的革命性领域，随着分子标记及质谱技术手段的不断发展革新，已被广泛应用于生命科学的诸多领域中。活性分子的靶点筛选与确证、针对特定靶点的特异性活性分子筛选、针对蛋白质特定活性氨基酸位点的分子互作鉴定等方面都有针对性的适用技术。此外，在共价药物开发和蛋白质相互作用研究等领域也具有独特优势。

本文介绍的各类化学蛋白质组学技术，达吉特均能为广大科研工作者提供服务。这些技术不仅是基础生物学研究中的利器，更在药物研发的各个环节发挥着革命性的作用，是推动精准医疗和未来药物发现与优化的核心引擎之一。